Эритроциты представляют собой клетки крови, изменение формы которых приводит к нарушению их основной функции, а именно способности переносить кислород, свободно перемещаясь по гемокапиллярам. Особенность эритроцитов заключается в их форме клетки – двояковогнутой форме диска. Данная форма обеспечивает наибольшее соотношение площади поверхности к объему клетки и гарантирует максимальную эластичность для свободного прохождения через капиллярные сосуды. При патологических состояниях под воздействием каких либо причин эритроциты изменяют свою форму и размер. Эритроциты с изменённой формой (сфероциты, стоматоциты и др.), не обладая высокой эластичностью, уже не могут проходить в узкие капилляры, общая площадь их поверхности становится меньше как минимум на 20 % от нормального соотношения.
Изменение структуры эритроцитов может происходить под действием как внутренних (эндогенных) факторов, так и под воздействием факторов окружающей среды [1, 2]. Мембраны эритроцитов очень чувствительны к внешним воздействиям. Изменение формы эритроцитов – процесс энергетически-зависимый и связан с концентрацией АТФ. Её снижение вызывает повышение чувствительности эритроцитов к факторам окружающей среды.
Метод анализа цитоархитектоники эритроцитов может быть использован как один из методов токсикологических исследований для оценки функциональных питьевых вод, рекомендуемых с целью оздоровления организма, в соответствии с современными требованиями как гигиенической оценки безопасности, так и биологической эффективности [3]. Электронномикроскопически в сканирующем режиме может быть получена информация о поверхностной геометрии эритроцитов, что позволит оценить структурно-функциональные свойства их мембран, а так как существует корреляция между изменением структуры мембран эритроцитов и других клеток организма [4], то и процессов повреждения клеточных мембран всего организма в целом.
В гигиене питьевых вод продолжают развиваться исследования, связанные с проблемой оценки качества питьевой воды при изменении ее структурного и изотопного водородно-кислородного состава [5]. Вода, являясь практически протиевой водой, имеет в своем составе другие изотопные модификации, содержание которых составляет 0,23 %, что сопоставимо с содержанием солей и микроэлементов в питьевой воде.
В основе механизма действия различных концентраций дейтерия на животных лежит влияние реакций изотопного обмена (D/H) на скорость биологических процессов в клетке (К. Райхардт, 1991). На молекулярном уровне этот механизм доказан, вода с пониженной концентрацией дейтерия увеличивает скорость биологических реакций (теpмодинамичеcкое cоcтояние нуклеиновыx киcлот, cкоpоcть пpоцеccов тpанcкpипции и тpанcляции, репарационные процессы ДНК, каскадные реакции дыхательной цепи митохондрий, аппарат биосинтеза, т.е. именно те клеточные системы, которые используют высокую подвижность протонов и высокую скорость разрыва водородных связей [6], а повышенное содержание дейтерия в воде, наоборот, стабилизирует клеточные структуры. В связи с этим целью настоящего исследования являлась оценка действия повышенного и пониженного содержания дейтерия в питьевой воде на показатели цитоархитектоники эритроцитов и клеток эритроидного ряда костного мозга крыс в хроническом эксперименте.
Материалы и методы исследования
Изучение влияния питьевых вод с различным содержанием дейтерия (10 ppm и 1000 ppm) на показатели состояния животных проводилось в хроническом эксперименте. В качестве контроля использовали воду с содержанием дейтерия 145 ppm, соответствующей концентрации дейтерия в московской водопроводной воде.
Общее состояние животных оценивали по показателям изменения массы тела, уровня водопотребления и поведению животных.
Исследования проводили на крысах-самцах массой в начале эксперимента 270 г. Животных содержали в условиях искусственного освещения (12 ч в сутки), постоянного доступа к стандартному комбинированному корму в клетках по 6 животных. Животные находились на свободном водопотреблении.
Электронномикроскопически в сканирующем режиме на «Hitachi-3010» анализировали цитоархитектонику эритроцитов, полученных из венозной крови после префиксации глутаральдегидом с дофиксацией OsO4 по стандартной методике (Б.В. Втюрин, А.А. Пальцын, 1996 г.) Затем проводилось обезвоживание в ацетоне и высушенные образцы покрывали слоем золота (толщиной в 200 А) в вакуумном испарителе. Для каждого животного просматривали на экране электронного микроскопа 250–280 эритроцитов и высчитывали процентное соотношение различных эритроцитов, классифицировав их по 12 типам (Г. Козинец, 1984). Статистические различия между показателями по отношению к контрольной группе определялись по непараметрическому критерию (U-критерий) Манна – Уитни. Достоверными считались изменения при Р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
В течение хронического шестимесячного периода наблюдения животные имели внешний вид и поведение, соответствующие хорошему общему состоянию. Общее состояние и поведение животных в контрольной группе заметно не отличалось от состояния в опытных группах, в течение всего времени эксперимента животные всех групп равномерно прибавляли в массе тела. Статистически значимых различий по показателю прироста массы в течение шести месяцев эксперимента выявлено не было. Водопотребление возрастало соответственно набору массы тела. Наблюдение за динамикой изменения показателей крови, таких как содержание эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов и гематокритной величины, не выявило существенных гематологических сдвигов, все величины находились в пределах физиологической нормы.
В соответствии с программой исследований на шестой месяц эксперимента проводился забой (по 6 животных из каждой группы) для изучения гистоморфологических показателей и цитоархитектоники эритроцитов.
Результаты проведенного сравнительного анализа формы, поверхности и размеров эритроцитов показали (табл. 1), что шестимесячное потребление воды с повышенной концентрацией дейтерия (1000 ppm) существенно ухудшало показатели цитоархитектоники эритроцитов крыс: наблюдалось достоверное снижение процентного содержания нормоцитов по сравнению с контролем до 61 + 2,4 % за счет достоверного снижения числа дискоцитов до 55 + 2 %. Суммарная доля дегенеративных эритроцитов достоверно увеличилась в 1,4 раза, достигая 21,9 + 2,7 %, в основном за счет эритроцитов с множественными изменениями поверхностной структуры. При этом установлено, что если в целом доля эритроцитов с необратимо изменённой формой достоверно не изменилась, то достоверно возросла доля трансформации эритроцитов в стоматоцит. Процентное содержание микро- и макроцитов значимо не отличалось от контрольной группы.
Таблица 1
Сравнительный анализ формы, поверхности и размеров эритроцитов при потреблении вод с различной концентрацией дейтерия, Ме [Q1;Q3]
|
Показатели/ исследованные концентрации дейтерия |
10 ppm дейтерия |
145 ppm дейтерия |
1000 ppm дейтерия |
|
Нормоциты, всего ( %) |
78,8 [77,2; 79,5] |
71,8 [70,8; 78,3] |
62,6 [58,4; 64,9]* |
|
Дискоцит, ( %) |
69,2 [67,2; 71,8] |
64,5 [60; 67,4] |
56,3 [54,3; 58,3]* |
|
Плоскоцит, ( %) |
8,65 [7,7; 12] |
10,4 [8,5; 11,9] |
4,8 [4,7; 7,3] |
|
Эритроциты с необратимо измененной формой, всего, ( %) |
10,6 [8,6; 12,4] |
10,8 [6,7; 12,3] |
13,7 [11,1; 16,5] |
|
конусообразный выступ, ( %) |
2,7 [1,6; 3,2] |
2,4 [2,3; 4] |
3,3 [2,7; 3,5] |
|
спущенный мяч, ( %) |
1,7 [0; 2,0] |
0,55 [0,4; 1,1] |
0,8 [0,4; 1,6] |
|
стоматоцит, парашют, ( %) |
3,2 [2,8; 3,7]* |
2,0 [1,2; 2,7] |
3,7 [3,2; 4,4]* |
|
с гребнем, ( %) |
2 [1,8; 3,6] |
2,85 [1,6; 3,6] |
3,6 [2,7; 5,2] |
|
сфероцит, ( %) |
1,35 [0,8; 2,4] |
1,6 [1,1; 2,9] |
0,9 [0,3; 2,4] |
|
Дегенеративные, всего, ( %) |
8,65 [7,6; 9,7]* |
14,9 [12; 17,2] |
21,0 [17,2; 24,7]* |
|
с одним боковым выростом, ( %) |
2,4 [2,0; 3,6]* |
4,9 [3,5; 6,6] |
5,7 [4,2; 6,9] |
|
Множественные выросты, ( %) |
3,5 [2,4; 4,5] |
6,6 [5,7; 6,9] |
9,3 [6,7; 14,2] |
|
Множественные изменения поверхностной структуры, ( %) |
1,6 [1,2; 2,7] |
1,95 [1,2; 3] |
5,5 [4,0; 6,6]* |
|
Микроцит, ( %) |
0,8 [0,8; 1,7] |
1,8 [1,2; 2,9] |
3,7 [1,2; 5,3] |
|
Макроцит, ( %) |
0 |
0 |
0 |
Примечание. * – достоверность по отношению к контрольной группе, P < 0,05. Данные представлены медианой и квартилями. Анализ различий проведен по критерию Манна – Уитни.
Потребление питьевой воды с пониженной концентрацией дейтерия (10 ppm) достоверно увеличивало процентное содержание нормоцитов в этой группе крыс по сравнению с группой, получающей повышенную концентрацию дейтерия, с контрольной группой, где крысы потребляли воду с концентрацией 145 ppm дейтерия, достоверных изменений не наблюдалось. Суммарная доля дегенеративных эритроцитов достоверно уменьшилась по сравнению с контролем в 1,6 раза и в 2,5 раза по сравнению с группой, потребляющей 1000 ppm дейтерия, достигая 8,7 + 0,85 %, в основном за счет эритроцитов с одним боковым выростом. Общее содержание эритроцитов с необратимо изменённой формой в эксперименте достоверно не изменилось, но при этом достоверно увеличена доля трансформации эритроцитов в стоматоцит. Процентное содержание микро- и макроцитов значимо не отличалось от контрольной группы.
Функциональная активность эритроцитов обеспечивает адаптацию всего организма к внешним воздействиям. Известно, что от формы эритроцитов частично зависит их стойкость к осмотическому гемолизу, аутогемолизу и, в меньшей степени, к механической травме. Наиболее ускоренный газообмен происходит в эритроцитах в форме двояковогнутого диска, так как дискоциты характеризуются высоким отношением площади поверхности к объему. Поэтому любая молекула гемоглобина, благодаря которой эритроциты осуществляют свою основную функцию – транспорт кислорода и углекислоты, находится близко к поверхности. В стареющих и дегенеративных формах эритроцитов происходит уменьшение энергетического потенциала клетки и, как, например, показано для сфероцитов, нарушается их способность поддерживать градиент натрия и калия, существующий в норме на их мембране [6]. В ряде исследований показано, что вода с повышенной концентрацией дейтерия замедляет скорость биологических реакций, в том числе каскадные реакции дыхательной цепи митохондрий, а изменение формы эритроцитов происходит на фоне истощения АТФ и изменения ионного равновесия за счет накопления Са благодаря угнетению Са АТФ-азы.
Таким образом, в ходе проведения сканирующей электронной микроскопии образцов крови экспериментальных животных, потреблявших воды с концентрацией дейтерия 10 и 1000 ppm, отмечалось, что морфологическая картина эритроцитов в крови животных, получавших воду с содержанием дейтерия 10 ppm, практически не отличалась от контрольной группы по проценту нормальных эритроцитов (нормоцитов), отмечалось снижение числа обратимых форм эритроцитов и рост их дегенеративных форм. Наименьший процент нормальных эритроцитов (нормоцитов) отмечался у животных, получавших воду с содержанием дейтерия, равным 1000 ppm, при этом достоверно увеличивалась доля эритроцитов с измененной формой и дегенеративными изменениями, что, прежде всего, указывает на снижение кислородтранспортной функции крови.
Оценка клеток костного мозга эритроидного ряда (табл. 2) показала, что в группе крыс, потреблявших питьевую воду с повышенным содержанием дейтерия, достоверно увеличен процент оксифильных нормоцитов и достоверно снижено число базофильных нормоцитов в костном мозге. В группе крыс, потреблявших воду с пониженным содержанием дейтерия (10 ppm), процентное содержание клеток эритроидного ряда значимо не отличалось от контроля. Увеличение числа оксифильных нормоцитов в костном мозге можно рассматривать как компенсаторную реакцию, вызванную повреждением эритроцитов, как это показано при исследовании поверхностной архитектоники эритроцитов, при потреблении воды с наивысшим содержанием дейтерия. Это подтверждается и расчетом индекса созревания эритроидных клеток, расчитываемым по формуле: (полихроматофильные + оксифильные нормоциты) / (проэритробласты + базофильные + оксифильные + полихроматофильные нормоциты). Данный индекс составляет 0,7 для группы, потреблявшей воду с пониженным содержанием дейтерия, 0,78 для контрольной группы и 0,84 для группы животных, потреблявших воду с повышенным содержанием дейтерия.
Таблица 2
Цитологический анализ эритроидного ряда клеток костного мозга, Ме [Q1;Q3]
|
Показатели / исследованные концентрации дейтерия |
10ppm |
145 ppm |
1000 ppm |
|
Эритробласты, ( %) |
0,2 [0,12; 0,26] |
0,1 [0,7; 0,11] |
0,25 [0,14; 0,36] |
|
Проэритробласты, ( %) |
2,1 [1,8; 3,6] |
2,0 [1,6; 3,2] |
1,5 [0,7; 5,4] |
|
Базофильный нормоцит, ( %) |
5,3 [3,5; 6,6] |
5,3 [3,0; 6,9] |
2,9 [1,6; 3,2]* |
|
Полихроматофильный нормоцит, ( %) |
13 [11,2; 16,3] |
14,8 [12,1; 17,2] |
12,8 [10,7; 15,3] |
|
Оксифильный нормоцит, ( %) |
4,7 [3,4; 5,7] |
5,4 [3,9; 7,1] |
9,8 [6,7; 14,3] * |
Примечание.* – достоверность по отношению к контрольной группе, P < 0,05. Данные представлены медианой и квартилями. Анализ различий проведен по критерию Манна – Уитни.
Измененные эритроциты крови крыс при воздействии воды с содержанием дейтерия 1000 ppm
Заключение
На основании сравнительного анализа результатов исследований сканирующей электронной микроскопии форм, поверхности и размеров эритроцитов и цитологического анализа эритроидного ряда клеток костного мозга нелинейных белых крыс в шестимесячном эксперименте выявлено негативное воздействие при длительном потреблении воды с повышенным содержанием дейтерия (1000 ppm). Содержание дейтерия в питьевой воде на уровне 10 ppm оказывало менее выраженное неоднозначное воздействие на показатели цитоархитектоники эритроцитов. Для интерпретации данных результатов требуется проведение дополнительных исследований.
Применение метода анализа цитоархитектоники эритроцитов и клеток эритроидного ряда костного мозга оправдано для оценки биологической безопасности и эффективности функциональных питьевых вод. Однако нужно заметить что, по мере увеличения возраста лабораторных животных, снижается процентное содержание нормоцитов при увеличении обратимо и необратимо измененных форм [7, 8], а сами эритроциты достаточно быстро реагируют на изменение факторов внешней среды [1, 2], поэтому сроки проведения экспериментальных исследований на животных можно сократить до 30–90 дней.