Для изучения таких важнейших биологических процессов, как азотфиксация, фотосинтез, исследование генома, влияние антропогенных факторов среды, используется хорошо приспособленная для исследования культура цианобактерии. С точки зрения резистентности к токсикантам, сравнительно малоизученным являются Synechocystis sp. Известно, что антропогенные факторы среды могут привести к нарушению авторегуляции механизмов формирования качества воды и самоочищения водной среды. При этом важное значение имеет количественная корреляция активных форм кислорода (АФК). Работы, посвященные АФК, отличаются тем, что одни авторы в своих работах важную роль придают окислительно-восстановительному потенциалу среды и перекиси водорода [1], иные исследователи – синглетному кислороду или супероксидному радикалу [2]. Эти исследования не расходятся между собой, напротив, взаимодополняют наши представления о роли АФК. Состояния водной среды в зависимости от экологической нагрузки антропогенного фактора, концентрации отдельных форм АФК в формировании качества воды становятся определяющими. Образование синглетного кислорода в водных экосистемах является следствием фотохимических реакций с участием фотосенсибилизаторов. Количество фотосенсибилизаторов в водоемах увеличивается за счет отходов химической, текстильной и нефтяной промышленности. Кроме непосредственного влияния синглетного кислорода на клеточную структуру популяции активированный кислород может изменять окислительно-восстановительный баланс водной среды. Показано, что синглетный кислород, реагируя с химическим составом среды, приводит его в более окисленное состояние, что способствует торможению роста культуры, т.е. питательные вещества становятся трудноусвояемыми для водорослей [3]. Токсические вещества, генерирующие АФК антропогенного и природного происхождения, приводят к экологическому стрессу и гибели водных организмов. Факторы среды, такие как температура воды, численность и видовой состав бактерии, а также количество фотосинтезирующих организмов в водоеме, являются определяющими для изменения концентрации АФК. Фотосенсибилизаторами природного происхождения являются хлорофиллы, фикобилины, порфирины, антибиотики, хинин, рибофлавин и промежуточные продукты их синтеза. Некоторые экзометаболиты, а также вещества, находящиеся в водной среде, вследствие лизиса клеток являются источником образования АФК. В настоящее время исследовано более тысячи соединений, генерирующих радикальные формы кислорода. Содержание АФК в водной среде увеличивается в результате попадания туда промышленных отходов, таких как отходы лакокрасочной, текстильной, фармакологической и косметической индустрии. При различных физико-химических условиях водной среды радикальные формы кислорода могут привести к летальному фотоокислению планктона или очистить сточные воды. Повреждающее действие синглетного кислорода на рост зеленных водорослей можно инактивировать шунгитом [3].
Цель исследования: изучить физиологические параметры роста цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803, в условиях культивирования с бенгальским розовым и шунгитом, по сравнению с зеленными водорослями Scenedesmus quadricauda; поиск новых, универсальных и экономически эффективных способов инактивации этих токсикантов.
Материалы и методы исследования
Биологическим объектом исследования были цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803, выращенные на среде BG 11 в конических колбах объемом 200 мл, при круглосуточном освещении 15 мкм кв. С.-1 м.-2, температура среды 25 °С. Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Концентрацию кислорода определяли на полярографе с закрытым платиновым электродом. Выделения кислорода на единицу хлорофилла (удельную активность) рассчитывали по ранее описанной методике. Спектр поглощения хлорофилла измеряли на спектрофотометре «Спекорд» UV-VIS. Для выделения хлорофилла использовали 90 % ацетон. [4]. Процент живых и мертвых клеток в культуре измеряли на люминесцентном микроскопе Carl ZeissAxioscop 2 FS Plus. При облучении цианобактерии сине-фиолетовыми лучами получали видимое свечение объекта: мертвые клетки имели зеленое свечение, а живые клетки – ярко-красное. В качестве источника синглетного кислорода использовали фотосенсибилизатор бенгальский розовый (Б.Р) 5 мг/л. Ингибитором активных форм кислорода был шунгит в количестве 10 г/л. Фотосенсибилизатор и шунгит добавляли в культуральную среду на третий день роста цианобактерии. Результаты исследования обрабатывали статистически, в программе Microsoft Office Excel 2010. Для графического отображения полученных результатов рассчитывали доверительный интервал. Оценку статистической значимости различий контрольной и опытных выборок проводили при помощи критерия Стьюдента для уровня 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Первые фильтры для очистки воды на основе шунгита были созданы в 1995 г., при этом вода, пропущенная через шунгит, обладает благоприятным действием на организм человека. Известно, что природный композит шунгит в основном состоит из углерода. В шунгите Зажогинской породы Карелии обнаружены практически все элементы таблицы Менделеева, кальций, алюминий, железо, кремний, магний, фосфор калий, сера и др. В 1992 г. в шунгитах Карелии был обнаружен фуллерен [5]. Показано, что фуллерены могут влиять на биологические мембраны, их структуру, изменять активность мембранных ферментов. В то же время механизм влияния на биологические объекты фуллеренов зависит от многих факторов [6]. Токсичность, нейтральность или положительное действие водорастворимых фуллеренов на клеточном, ферментативном и организменном уровнях зависят от способов получения, чистоты этого соединения, концентрации, а также особых свойств водных сферических оболочек фуллеренов, являющихся одновременно донором и акцептором электронов [2, 6].
Продажа и реклама шунгита продолжает увеличиваться, в то же время исследование влияния этого соединения на биологические объекты и на организм человека мало исследовано. Применение фуллеренов как в медицине, так и в научных исследованиях на биологические объекты, мало изучено в связи с их высокой стоимостью. Высокая цена фуллерена имела основное значение при выборе для наших исследованиях шунгита как возможного протектора от токсического действия синглетного кислорода на развитие гидробионтов, в то же время – это вещество в своей структуре содержит фуллерен. Фотохимические реакции с участием сенсибилизаторов в водоеме приводят к образованию АФК, в связи с этим в нашей работе был использован шунгит из Зажогинского месторождения, как возможного ингибитора радикальных форм кислорода.
Как видно из рис. 1, культура цианобактерии растет лучше в присутствии 10 мг/л шунгита по сравнению с контролем и наоборот, рост культуры снижается при наличии в среде 5 мг/л бенгальского розового. Одновременно шунгит защищает рост культуры от токсического воздействия БР при совместном присутствии в среде культивирования.
Рис. 1. Влияние бенгальского розового и шунгита на численность цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803
По сравнению с зелеными водорослями цианобактерии более чувствительны к шунгиту, и если 10 г/л шунгита достаточно для стимулирования роста цианобактерии, то для зеленых водорослей необходимо 100 г/л [3]. В специальных опытах было показано, что при концентрациях шунгита 200 г/л рост культуры зеленых водорослей Scenedesmus guadricauda, подавляется в 2 раза. В более высоких концентрациях – 300 г/л шунгит тормозит рост практически полностью. В опытах с цианобактериями стимулирование роста культуры начинается с 1 г/л шунгита, более выражено при 10 г/л шунгита. Увеличение роста культуры цианобактерии на 7-й день роста по сравнению с контрольным в присутствии шунгита 10 г/л составляет 25 %. Заметное торможение роста цианобактерии начинается с 30 г/л и составляет 35 % процентов от роста контрольных проб. При более высоких концентрациях – 60 г/л шунгита рост культуры цианобактерии останавливается практически полностью. То есть цианобактерии в 10 раз чувствительнее к шунгиту, чем зеленые водоросли. Это очень важно учесть при использовании шунгита для очистки воды от высокой концентрации АФК. Культура Scenedesmus quadricauda в присутствии бенгальского розового 5 г/л окрашивается, что свидетельствует о проникновении красителя внутрь клеток. Таким образом при определенных концентрациях можно стимулировать рост одних видов и подавлять рост других видов микроорганизмов.
Как видно из рис. 2, в начале стационарной фазы на 15 сутки роста процент мертвых клеток намного больше (23 %), когда в среде только бенгальский розовый 5 мг/л (4). Присутствие 10 г/л шунгита в среде, токсическое действие БР частично инактивируется (3).
Рис. 2. Количество мертвых клеток цианобактерии в начале стационарной фазы роста с наличием бенгальского розового и шунгита в среде. 1. Контроль, 2. Контроль + шунгит 10 г/л, 3. Контроль + БР 5 г/л + шунгит 10 г/л, 4. Контроль + БР 5 г/л, 5. Контроль + шунгит 30 г/л
Рис. 3. Влияние бенгальского розового и шунгита на удельную активность выделения кислорода рассчитанного на единицу хлорофилла «a»
Наличие в среде 10 г/л шунгита уменьшает процент мертвых клеток цианобактерии до 7,5 % рис. 2 (2), при 30 г/л шунгита число мертвых клеток увеличивается до 65 % рис. 2. (5). Таким образом шунгит в зависимости от концентрации может стимулировать рост клеток цианобактерии, подавлять их рост, или инактивировать действие токсиканта.
В логарифмической фазе роста Scenedesmus quadricauda в присутствии бенгальского розового 5 г/л и шунгита в расчете 100 г/л наблюдали незначительное уменьшение количества делящихся клеток и увеличение количества клеток покоящихся, в вышеуказанных концентрациях шунгит частично инактивировал токсическое действие БР В культуре Synechocystis sp. при тех же условиях культивирования в логарифмической фазе роста быстро возрастает количество мертвых клеток, а количество делящихся клеток резко падает. Количество покоящихся клеток в культуре Synechocystis sp. в процессе культивирования относительно постоянно, и если покоящиеся клетки Scenedesmus quadricauda могут превращаться в делящиеся в процессе восстановления культуры, то у Synechocystis sp. этого не наблюдалось. Как видно из рис. 3, удельная активность выделения кислорода популяции цианобактерии имеет схожую зависимость в аналогичном случае при влиянии бенгальского розового и шунгита на численность клеток (рис. 1).
Известно, что выделение кислорода на единицу хлорофилла отражает эффективность фотосинтеза. Можно с уверенностью сказать, что изменение вышеуказанных физиологических параметров роста культуры является следствием повреждения фотосистемы культуры. В работе показано, что при больших концентрациях красителя синглетный кислород проникает в клетку и изменяет различные параметры фотосинтеза и редок-с потенциал среды. В концентрациях ниже 4 мг/л изменяет только частично редок-с потенциал среды. Таким образом в зависимости от концентрации шунгита в среде культивирования (а также от вида культуры) редок-с потенциал среды становится более благоприятным, что способствует стимулированию роста данного вида культуры и наоборот, при более высоких концентрациях тормозит рост этой культуры. В конечном итоге мы видим увеличение или торможение численности клеток, удельной активности выделения кислорода (рис. 1, 3).
Заключение
На основании полученных результатов показано, что концентрации шунгита для инактивации синглетного кислорода отличаются в 10 раз у водорослей и цианобактерии. Культура Synechocystis sp. более чувствительна к воздействию как шунгита, так и бенгальского розового. Большинство исследователей связывают механизм токсического, защитного или нейтрального действия шунгита на организменном уровне со свойством фуллеренов и количеством его содержания в шунгите. Полученные нами результаты согласуются с концепциями, изложенными в работах [2, 6].
Таким образом, на основании полученных наших и литературных данных, вопрос об использовании шунгита, как протектора токсикантов для очистки воды намного сложнее, чем это демонстрируют торгующие компании и некоторые исследователи. Резистентность к шунгиту у цианобактерии и водорослей отличается в 10 раз. Поэтому на вопрос, рост и развитие какого вида гидробионта мы хотим получить в водоеме, ответ будет разный.
С нашей точки зрения, без предварительного гидробиологического и гидрохимического анализов эти вопросы трудно решить.
Работа выполнена в рамках темы по госзаданию (№ ЦИТИС: АААА-А16- 116021660054-4).