В настоящее время продолжает оставаться актуальным вопрос определения химического состава ветеринарной субстанции АСД-2Ф (в дальнейшем – субстанции).
Известно [1], что с химической точки зрения АСД-2Ф представляет раствор органических веществ – продуктов совместного пиролиза белков и жиров животного происхождения – в водно-аммонийном буферном растворе, причём именно их определение вызывает наибольшие затруднения.
Определенных успехов в решении данной задачи достигли авторы [2], обнаружившие методом хромато-масс-спектроскопии в составе органической части АСД-2Ф около 120 индивидуальных органических веществ. Однако отсутствие фактических данных по методике проведения эксперимента не позволяет в полной мере применять полученные результаты на практике.
Цель работы: исследование химического состава субстанции АСД-2Ф и её концентратов методами газожидкостной хроматографии и хромато-масс-спектроскопии.
Материалы и методы исследования
Во всех опытах использовали образцы субстанции АСД-2Ф, произведенной ООО «Ареал Медикал», а также образцы концентратов субстанции (в дальнейшем – органическая часть, или ОЧ), приготовленные по разработанному нами ранее способу [3].
Газожидкостная хроматография
Подготовку пробы субстанции АСД-2Ф проводили следующим образом: в пластиковую пробирку для центрифугирования объёмом 15 мл пипеткой помещали 0,5 г субстанции, после чего туда же добавляли 10 мл этанола. Ввиду образования суспензии из-за выпадения осадка углеаммонийных солей пробирку центрифугировали в течение 10 мин при скорости вращения 3500–3900 об/мин, после чего из осветлённой части отбирали пробу для анализа.
ОЧ получали концентрированием органических веществ субстанции в соответствии с [3] упариванием образцов исходной субстанции в электрическом шкафу при температурах 60, 80, 100 °С до прекращения убыли веса. Масса органической части обычно составляла 5,5÷7 % от исходной при времени нагрева от 2,5 ч (для 100 °С) до 10 ч (для 60 °С).
После окончания упаривания готовили раствор концентрата (ОЧ) в этаноле из расчёта 10 мл растворителя на 0,5 г подготовленной пробы.
В качестве стандартов использовали реактивы с содержанием основного вещества не менее 95,0 %, причём значительное количество составили стандартные образцы для хроматографии, закупленные в российских фирмах. Такие вещества, как 2-пироллидинон, 2-пиперидинон, 3-метилбутанамид, 2-амино-3-метилпиридин, 5,5-диметилгидантоин, 5-этил-5-метилгидантоин, произведённые Асros Organics, 3-изобутил-1,6-пропилен-2,5-дикетопиперазин, произведенный фирмой Santa Crus Biothechnology, были предоставлены НВЦ «Агроветзащита».
Исследование проводили на хроматографе Хроматэк-Кристалл-5000.1 2003 г. выпуска в комплектации: испаритель капиллярный, детектор пламенно-ионизационный и капиллярная колонка ZB-FFAP 50 м×0,32 мм×0,50 µм. Режим работы хроматографа: температура испарителя 250 °С, температура ПИД 250 °С, начальная температура колонки 145 °С, выдержка начальной изотермы 1 мин, скорость подъема температуры колонки 10 град/мин, конечная температура колонки 225 °С. Газ-носитель гелий в режиме поддержания постоянного давления перед колонкой 150 КПа, коэффициент деления потока 1/30, режим экономии газа. Газовый режим ПИД: расход водорода 30 мл/мин, расход воздуха 300 мл/мин, поддув инертного газа (гелия) 30 мл/мин. Объем вводимой в испаритель пробы 1 мкл. Общая длительность анализа 70 мин.
Выбор FFAP в качестве фазы капиллярной колонки был обусловлен тем, что значительное число индивидуальных веществ АСД-2Ф являются полярными азотсодержащими соединениями с молекулярной массой до 150–200 углеродных единиц, что позволяло ожидать достаточно качественное разделение компонентов смеси.
Хромато-масс-спектроскопию (ГХ-МС) образцов АСД-2Ф проводили на газовом хроматографе Shimadzu GC-2010 Plus, оборудованном пламенно-ионизационным детектором, масс-детектором GCMS-QP2020 и капиллярной колонкой НР-5 30м×0,32мм×0,25 мкм. Режим проведения анализа: температура испарителя 250 °С, температура ПИД 250 °С, температура ионного источника 210 °С, температура интерфейса 210 °С, температурная программа термостата колонки – 140 °С 15 мин, нагрев 10 °С/мин до 240 °С, общее время анализа 35 мин. Газ-носитель гелий в режиме постоянного давления перед колонкой 53 кПа, коэффициент деления потока 1/20, расход водорода 40 мл/мин, воздуха 400 мл/мин. Режим работы масс-детектора: температура ионного источника 210 °С; температура интерфейса 210 °С, скорость сканирования – 1425, интервал сканируемых масс – от m/z 30 до m/z 450, скорость развертки одного цикла – 0,3 с, напряжение детектора – 0,9 кВ, устранение эффекта растворителя – 1,5 мин.
Выбор фенил (5 %)полиметилсилоксана в качестве фазы капиллярной колонки был обусловлен тем, что данная фаза является менее полярной и более высокотемпературной, чем FFAP. Это должно было позволить получить на хроматограмме пики веществ с большей молекулярной массой, чем на колонке с FFAP.
Анализу подвергали раствор ОЧ АСД-2Ф в этаноле (0,5г в 10 мл соответственно), полученной в результате упаривания исходных образцов в течение 3 ч при температуре 80 °С.
Расшифровку полученных масс-спектров проводили с использованием программного обеспечения GCMS PostrunAnalysis. Идентификацию компонентного состава образцов проводили сравнением масс-спектра компонента, присутствующего в пробе, с его библиотечным масс-спектром (базы данных библиотек – NIST-14 и NIST-14s).
Результаты исследования и их обсуждение
В результате анализа непосредственно субстанции АСД-2Ф методом ГЖХ были получены хроматограммы, содержащие до 80 пиков, а концентрирование субстанции позволило в тех же условиях получить хроматограммы, содержащие до 140 пиков индивидуальных органических веществ.
При обработке полученных хроматограмм учитывали лишь пики с соотношением сигнал/шум более 10. При увеличении соотношения сигнал/шум до 20 и 50 количество пиков уменьшалось лишь на 3–10 %, а суммарная площадь пиков уменьшалась лишь на 5–20 % соответственно.
Идентификация и количественное определение содержания некоторых компонентов субстанции проводились на основе модельных (искусственно приготовленных) смесей, содержащих 26 компонентов, доступных в приобретении и распределенных по всей протяжённости получаемой хроматограммы. Градуировку хроматографа проводили по 4–5 смесям в диапазоне концентраций веществ-стандартов от 0,05 до 8 % мас.
В табл. 1 представлены основные результаты этих исследований.
Из данных табл. 1 видно, что использование для разделения колонки ZB-FFAP позволило установить более 50 % мас. органических веществ, входящих в состав субстанции АСД-2Ф.
Таблица 1
Влияние условий упаривания на содержание органических веществ в концентрате АСД-2Ф
|
№ поз. |
Наименование вещества-стандарта |
Время удерживания TR, мин |
Содержание вещества, % мас. |
|||
|
Исходный АСД-2Ф |
Условия концентрирования (температура, °С)/ длительность выдержки, час) |
|||||
|
60/10 |
80/3 |
100/2,5 |
||||
|
1 |
2-Метилпиридин |
3,11 |
0,01 |
0 |
0 |
0 |
|
2 |
Диметилформамид |
3,63 |
0,1 |
0,04 |
0,04 |
0,01 |
|
3 |
Уксусная к-та |
3,85 |
0,727 |
0,131 |
0,26 |
0,004 |
|
4 |
N,N-Диметилацетамид |
4,04 |
0,03 |
0,073 |
0,071 |
0 |
|
5 |
Пропионовая к-та |
4,36 |
0.072 |
0,066 |
0,085 |
0,024 |
|
6 |
Масляная к-та |
4,99 |
0,230 |
0,061 |
0,106 |
0 |
|
7 |
Изовалериановая к-та |
5,37 |
0,01 |
0,086 |
0,073 |
0,013 |
|
8 |
N-Метилацетамид |
5,42 |
0,017 |
0,087 |
0,077 |
0,012 |
|
9 |
N-Метилформамид |
5,52 |
0,005 |
0,022 |
0,02 |
0 |
|
10 |
Валериановая к-та |
5,89 |
0,01 |
0,083 |
0,084 |
0,01 |
|
11 |
Ацетамид |
6,47 |
0,39 |
1,155 |
1,205 |
0,165 |
|
12 |
Пропионамид |
6,80 |
0,16 |
0,529 |
0,535 |
0,086 |
|
13 |
Капроновая к-та |
6,87 |
0,01 |
0,119 |
0,12 |
0,007 |
|
14 |
Бутирамид |
7,62 |
0,034 |
0,159 |
0,156 |
0,057 |
|
15 |
3-Метилбутанамид |
7,88 |
0,09 |
0,188 |
0,107 |
0,067 |
|
16 |
2-Аминопиридин |
7,97 |
0,024 |
0,177 |
0,147 |
0,053 |
|
17 |
2-Амино-3-метил-пиридин |
8,21 |
0,012 |
0,088 |
0,086 |
0,03 |
|
18 |
Уротропин |
8,57 |
0,054 |
0,053 |
0,055 |
0,027 |
|
19 |
Валерамид |
8,71 |
0,034 |
0,025 |
0,024 |
0,013 |
|
20 |
Каприловая к-та |
8,94 |
0,002 |
0,112 |
0,395 |
0,575 |
|
21 |
2-Пирролидинон |
9,63 |
0,08 |
0,898 |
0,901 |
0,550 |
|
22 |
2-Пиперидинон |
10,81 |
0,36 |
1,985 |
1,87 |
2,096 |
|
23 |
Пиколинамид |
14,51 |
0,068 |
0,113 |
0,151 |
0,047 |
|
24 |
5,5-Диметилгидантоин |
33,90 |
0,68 |
10,404 |
10,488 |
9,86 |
|
25 |
5-Метил-5-этил-гидантоин |
39,20 |
0,31 |
4,106 |
4,08 |
4,456 |
|
26 |
3-Изобутил-1,6-пропилен-2,5-дикетопиперазин |
57,20 |
0,03 |
0,292 |
0,394 |
0,827 |
|
27 |
Всего веществ – стандартов, % |
3,48 |
21,05 |
21,5 |
18,99 |
|
|
28 |
Всего веществ-маркеров, % |
2,86 |
18,40 |
18,55 |
16,67 |
|
|
28 |
Содержание ОЧ, % |
6,3 |
6,55 |
6,3 |
5,45 |
|
|
30 |
Определено веществ ОЧ, % |
55,2 |
22,9 |
22,2 |
19,1 |
|
Набор веществ-стандартов, включающий представителей самых различных групп органических соединений и представленный в табл. 1, практически исключает возможность фальсификации препарата. Одновременно нельзя не отметить, что для реализации метода анализа в производственных условиях достаточно использовать нескольких маркерных веществ, отличающихся высоким содержанием в субстанции, легкодоступных при приобретении, а также достаточно стабильных при хранении.
Эти вещества выделены в таблице «жирным» шрифтом: уксусная кислота, масляная кислота, ацетамид, пропионамид, 2-пиперидинон, 5,5-диметилгидантоин, 5-метил-5-этилгидантоин, причём их суммарная концентрация составляет более 40 % от массы ОЧ.
Анализ этих данных с точки зрения химического состава ОЧ также показывает, что значительное количество органических веществ АСД-2Ф относятся к жирным органическим кислотам, а также их амидам. Суммарная концентрация органических кислот практически равна 1 %, так же как и амидов данных кислот.
Следует учитывать, что вещества, определяемые на хроматограмме как органические кислоты, существуют в исходном АСД-2Ф в виде их соответствующих аммонийных солей. Поэтому нами было проведен специальный опыт, доказывающий, что в представленных условиях анализа кислоты и их аммонийные соли в исходной пробе дают одинаковый результат хроматографического анализа.
Достаточно много в АСД-2Ф индивидуального вещества 2-пиперидинона, концентрация которого составляет около 0,4 %.
Особый интерес представляют 5,5-алкилпроизводные гидантоинов, имеющие высокую суммарную концентрацию (около 1 %) и обладающие подтверждённым антисептическим действием
Рассматривая изменение химического состава образцов АСД-2Ф в результате выдержки при различных температурах можно отметить, что упаривание образцов АСД-2Ф даже при относительно невысокой (до 60 °C) температуре позволяет осуществить концентрирование органических веществ субстанции. Так, например, содержание производных гидантоинов в концентрате повышается в 15 раз по сравнению с исходной субстанцией.
При выдержке образцов при температуре 100 °C начинается интенсивное испарение легколетучих веществ и воды, в результате чего на хроматограмме концентрата наблюдается менее половины из использованных 26 веществ-стандартов.
Таким образом, наиболее подходящими условиями подготовки субстанции АСД-2Ф для производственного ГЖХ-анализа является, по мнению авторов, концентрирование органических веществ при температуре 80 °C в течение 3 ч.
В табл. 2 представлены результаты хромато-масс-спектроскопии субстанции АСД-2Ф (условные обозначения: t – время удерживания, мин; S – относительная площадь сигнала, %; SI – степень совпадения с данными библиотеки; [2, 4] литературные результаты).
Таблица 2
Результаты ГХ-МС субстанции АСД-2Ф
|
№ поз. |
Наименование вещества |
Параметры сигнала |
Данные [2, 4] S, % |
||
|
t, мин |
S, % |
SI, ед. |
|||
|
1 |
Пропионовой кислоты амид |
2,596 |
0,77 |
92 |
4,41 |
|
2 |
Масляной кислоты амид |
2,797 |
0,34 |
88 |
0,07 |
|
3 |
Глицерин |
2,869 |
0,83 |
96 |
|
|
4 |
Изовалериановой кислоты амид |
2,965 |
0,67 |
90 |
4,81 |
|
5 |
Метилянтарной кислоты ангидрид |
3,097 |
3,63 |
90 |
|
|
6 |
6-Гептеновая кислота |
3,168 |
0,55 |
72 |
5,0 |
|
7 |
2-Пирролидинон |
3,361 |
1,07 |
95 |
2,0÷7,0 |
|
8 |
3-Пиридинол |
3,416 |
2,77 |
93 |
0,13 |
|
9 |
N-Циклогексилформамид |
3,577 |
2,59 |
72 |
|
|
10 |
3-Амино-2,4-диметилпентан |
3,897 |
0,15 |
85 |
|
|
11 |
Гексанамид |
4,097 |
0,67 |
90 |
|
|
12 |
N-Ацетилпирролидин |
4,130 |
0,76 |
73 |
|
|
13 |
2-Пиперидинон |
4,274 |
3,19 |
96 |
8,0÷15,7 |
|
14 |
Дигидро-3-метил-2,4-пиримидиндион |
5,090 |
0,76 |
81 |
|
|
15 |
Пиколинамид |
5,172 |
0,28 |
79 |
1,8 |
|
Окончание табл. 2 |
|||||
|
№ поз. |
Наименование вещества |
Параметры сигнала |
Данные [2, 4] S, % |
||
|
t, мин |
S, % |
SI, ед. |
|||
|
16 |
5,5-Диметилгидантоин |
5,879 |
25,36 |
96 |
4,6÷6,3 |
|
17 |
5-Метилгидантоин |
6,291 |
2,37 |
91 |
|
|
18 |
3-Фенилнпропионовая кислота |
6,393 |
0,36 |
80 |
|
|
19 |
Капролактам |
6,73 |
0,33 |
73 |
0,29 |
|
20 |
5-Метил-5-этилгидантоин |
7,828 |
13,38 |
94 |
3,7 |
|
21 |
N-(-1-Метилпропил)-2-бутанамин |
7,945 |
0,45 |
82 |
|
|
22 |
5-Этилгидантоин |
8,22 |
1,22 |
93 |
1,85÷4,62 |
|
23 |
2-Ацетамидо-N-метилбутирамид |
8,569 |
0,24 |
75 |
0,32 |
|
24 |
N-Метилфталимид |
9,041 |
0,11 |
82 |
|
|
25 |
N, N-Дибутилформамид |
9,359 |
1,16 |
74 |
|
|
26 |
5-(2-Метилпропил)-гидантоин,(S) |
9,750 |
2,84 |
90 |
|
|
27 |
5-Метил-5-(2-метилпропил)-гидантоин,(S) |
10,291 |
0,17 |
86 |
|
|
28 |
3,3/-Тиобиспропионитрил |
10,474 |
0,63 |
93 |
0,13 |
|
29 |
Нитрил миристиловой кислоты |
10,752 |
0,22 |
73 |
|
|
30 |
6-Аминоиндазол |
11,305 |
3,07 |
80 |
|
|
31 |
N-Метил-N-гексадецилэтиламин |
12,344 |
0,16 |
71 |
|
|
32 |
3,6-Диметил-2,5-дикетопиперазин |
12,667 |
0,93 |
66 |
|
|
33 |
N-Циклогексилимид янтарной кислоты |
14,482 |
0,75 |
73 |
|
|
34 |
2-Метил-1-Н-пирроло [2,3-b] пиридин-6-амин |
14,996 |
1,21 |
85 |
|
|
35 |
1-Н-Имидазо (4,5-d) пиразин-7-ол |
15,676 |
0,68 |
80 |
|
|
36 |
6-Метил-[1,2,4] триазоло [4,3-b] пиразин-8-ол |
16,644 |
0,59 |
73 |
|
|
37 |
7-Метиладенин |
17,753 |
0,18 |
61 |
|
|
38 |
3-Изопропил-6-метил-2,5-дикетопиперазин |
18,022 |
0,44 |
82 |
1,3÷2,4 |
|
39 |
(3S,6S) -3-Бутил-6-метилпиперазин-2,5-дион |
18,385 |
0,75 |
82 |
|
|
40 |
1,3-Диметилтетрагидро-2-пиримидинон |
18,764 |
0,16 |
81 |
|
|
41 |
(Е)-3-Гексеновая кислота |
19,379 |
0,86 |
54 |
|
|
42 |
Дециловый эфир N-винилкарбонилглицина |
20,392 |
2,07 |
73 |
|
|
43 |
N-ацетил -3-метил-1,4 –диазабицикло [4.3.0] нонан-2,5 дион |
20,523 |
0,56 |
85 |
|
|
44 |
3,6-Диизопропил -2,5-дикетопиперазин |
20,744 |
0,71 |
83 |
2,4÷6,3 |
|
45 |
Мочевая кислота |
21,030 |
4,16 |
78 |
3,48 |
|
46 |
3-Изобутил-1,6-пропилен-2,5-дикетопиперазин |
21,479 |
5,87 |
96 |
3,8-7,0 |
|
47 |
1-(2-Пропил-1,2,4-триазол-3-ил)-этанамин |
21,950 |
0,34 |
74 |
|
|
48 |
1,3-Диметилдигидро -2,4(1Н,3Н)-пиримидиндион |
22,469 |
0,48 |
68 |
|
|
49 |
L-Пролин, N-валерил, гептадециловый эфир |
22,584 |
0,22 |
79 |
|
|
50 |
3,6-диизобутил -2,5-дикетопиперазин |
23,063 |
1,99 |
57 |
|
|
51 |
L-Пролин, N-валерил, октадециловый эфир |
24,474 |
0,16 |
76 |
|
|
52 |
5,10-Диэтокси-2,3,7,8-тетрагидро-1Н,6Н-дипирроло-[1,2-a;1', 2’-d]-пиразин |
24,639 |
4,03 |
90 |
3,0-9,2 |
|
53 |
3-Бензил-1,6-пропилен-2,5-дикетопиперазин |
31,365 |
0,13 |
91 |
|
|
ИТОГО, % |
98,3 |
||||
Выбор индивидуальных веществ производили не только по степени соответствия характеристик спектра соответствующим библиотечным данным, но и с учётом существующих представлений [5–7] о возможном механизме совместного пиролиза белков и жиров животного происхождения в безвоздушной среде при температуре в диапазоне 200–500 °С.
При этом основной чертой механизма пиролиза мы считали возможное образование из аминокислот, представленных в животных белках, циклических и линейных дипептидов, а также их производных. Предполагали, что дипептиды могли бы образоваться из таких аминокислот, как глицин, лейцин, фенилаланин, аланин, валин, пролин, гидроксипролин, изолейцин.
Однако до сих пор по данным [2, 4] удалось обнаружить в аналогичных продуктах пиролиза лишь 3-изобутил-1,6-пропилен-2,5-дикетопиперазин и эфирное производное дипептида 5,10-диэтокси-2,3,7,8-тетрагидро-1Н,6Н-дипирроло [1,2-a; 1’,2’-d] пиразин. Поэтому мы обоснованно предполагали, что в спектре анализируемых образцов АСД-2Ф должны присутствовать и иные дипептиды. Наличие этих веществ не удалось определить методом ГЖХ с колонкой FFAP, в то время как ГХ-МС с использованием колонки НР-5 позволило определить наличие десяти дипептидов и их эфиров.
Для органической части всего нами были определены 150 веществ, причём 53 вещества, представленные в табл. 2, имеют относительную площадь сигнала более 0,1 %, а сумма относительных площадей их пиков составляет более 98 %.
Эти вещества распределяются по нескольким основным группам: более 90 % всех веществ (по суммарной относительной площади сигнала) представляют азотосодержащие вещества, в том числе:
– амиды карбоновых кислот и амины – более 7 %;
– алкилгидантоины – 32 %;
– дипептиды, в том числе циклические – 16 %.
Остальные вещества являются отдельными представителями лактамов и других азотосодержащих гетероциклов, производными аминокислот и карбоновых кислот. Жирным шрифтом в таблице выделены вещества, возможность использования которых в качестве маркеров химического состава АСД-2Ф обсуждалась нами при рассмотрении данных табл. 1.
В диапазоне времени удерживания 8–32 минуты, то есть после 5-метил-5-этилгидантоина, методом ГХ-МС были найдены около 30 веществ с суммарной относительной площадью пиков более 30 %, которые не наблюдались на хроматограмме при проведении определения на колонке FFAP.
Выводы
1. Показано, что совместное применение газожидкостной хроматографии с капиллярной колонкой ZB-FFAP и хромато-масс-спектрометрии с капиллярной колонкой НР-5 позволяет определить наличие около 170 пиков веществ, входящих в состав органической части субстанции АСД-2Ф.
2. Определена концентрация 26 органических веществ-стандартов, входящих в состав органической части субстанции АСД-2Ф. Суммарное содержание этих веществ составляет около 50 % (мас.) от общего количества органических веществ в АСД-2Ф, причём более 40 % (мас.) составляют семь легкодоступных веществ-маркеров (уксусная и масляная кислоты, а также их соответствующие амиды; 2-пиперидинон; 5,5-диметилгидантоин и 5-метил-5-этилгидантоин).
3. Впервые установлено значительное количество среди органических веществ субстанции циклических дипептидов и их производных, таких как 3,6-диметил-2,5дикетопиперазин, 3-изопропил-6-метил-2,5-дикетопиперазин, 3,6-диизопропил-2,5дикетопиперазин, 3,6-диизобутил-2,5-дикетопиперазин, 3-бензил-1,6-пропилен-2,5-дикетопиперазин, N-ацетил-3-метил-1,4-диазабицикло-[4.3.0]-нонан-2,5-дион, а также 1,3-диметилдигидро-2,4(1Н,3Н)-пиримидиндион, и подтверждено наличие в препарате АСД-2Ф двух найденных ранее гетероциклических дипептидов пролина: 3-изобутил-1,6-пропилен-2,5-дикетопиперазина и 5,10-диэтокси-2,3,7,8-тетрагидро-1Н,6Н-дипирроло-[1,2-a; 1',2'-d]-пиразина.
Выражаем благодарность канд. хим. наук А.Л. Есиповичу, доценту кафедры «Химическая технология» Дзержинского политехнического института (филиала) НГТУ имени Р.Е. Алексеева за участие в проведении анализов АСД-2Ф методом ГХ-МС и помощь в обсуждении полученных результатов, а также канд. ветеринар. наук Е.С. Енгашевой, начальнику отдела НВЦ «Агроветзащита», канд. хим. наук В.А. Кашаеву, нач. отдела АО «ГосНИИ «Кристалл» за помощь в подборе и приобретении образцов стандартов химических веществ и обсуждении результатов.