Дейтерий – стабильный изотоп водорода, содержащийся в поверхностных водах в концентрации около 0,015 % (150 мг/л) в виде оксида протодейтерия DHO. К настоящему времени опубликовано значительное количество научных работ по изучению биологической активности «легкой воды», содержащей пониженные концентрации дейтерия [1–3] и предположительно обладающей благотворным влиянием на организм человека, в том числе как дополнительное защитное средство для коррекции различных патологических состояний [4–6]. Некоторые исследователи связывают адаптогенное действие «легкой воды» с ее антиоксидантными свойствами и способностью влиять на систему оксидантного равновесия организма, используя для оценки скорости свободнорадикальных реакций в биопробах такие методы, как ЭПР и ЯМР [7, 8], измерение интенсивности спонтанной и индуцированной хемилюминесценции [9], определение содержания малонового диальдегида и активности антиоксидантных ферментов [10]. В то же время возможные биологические эффекты повышенных концентраций оксида дейтерия остаются обычно за рамками исследований на лабораторных животных, хотя и предполагается по умолчанию, что они обладают повреждающим действием. Кроме того, опыты по введению животным питьевых вод с пониженными концентрациями дейтерия ограничены обычно сроками порядка одного-двух месяцев воздействия, в то время как в гигиене приняты длительные сроки моделирования натурных условий, с проведением хронических экспериментов в течение 6–12 месяцев.
Цель исследования: сравнительный анализ влияния пониженного и повышенного содержания дейтерия в питьевой воде на показатели окислительного стресса в пробах крови лабораторных крыс в хроническом эксперименте.
Материалы и методы исследования
Эксперимент проводился на белых нелинейных крысах с исходной массой тела 200–220 г (по 10 крыс в каждой группе). Животные содержались при естественном освещении на обычном гранулированном корме в условиях свободного доступа к исследуемым образцам питьевой воды:
– вода с содержанием дейтерия 145 мг/л, соответствующем его концентрации в московской водопроводной воде;
– вода с пониженными концентрациями дейтерия (10; 30; 60 и 90 мг/л);
– вода с повышенными концентрациями дейтерия (250 и 1000 мг/л).
Образцы питьевой воды, использованные в данном исследовании, соответствовали высшей категории качества, имели одинаковый макро- и микроэлементный химический состав и различались только по содержанию оксида дейтерия.
Через 1, 2, 6 и 12 мес. после начала опыта отбирали пробы крови из подъязычной вены крыс. В качестве показателей окислительного стресса использовали значения интенсивности люминол-зависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) сыворотки крови животных, которую измеряли при температуре 37 °С, используя в качестве индуктора перекись водорода.
В состав инкубационной среды входили следующие компоненты: 140 мМ Nа-фосфатного буфера (pH 7,4); 1 мМ Na2-ЭДТА (натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты); 50 мкМ люминола (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндиона) и 10 мкл/мл сыворотки крови [11]. Запуск реакции производили добавлением перекиси водорода в конечной концентрации 6 мМ. Интенсивность возникающего хемилюминесцентного сигнала регистрировали в течение 60 с (между 10 и 70 секундами после добавления перекиси водорода) в термостатируемой ячейке люминометра «Lucifer-02M», подключенного к компьютеру. Сохраненные двоичные файлы конвертировали и переносили в компьютерную программу Microcal Origin v. 3.0 для расчета светосуммы хемилюминесцентных сигналов (общего количества импульсов света за одну минуту). Данные выражали в виде десятичных логарифмов рассчитанных светосумм, так как максимумы распределения исходных значений светосумм у людей и животных резко сдвинуты влево [12].
Достоверность межгрупповых различий определяли с помощью двустороннего непараметрического теста Манна – Уитни в программе Statistica v.6.0.
Результаты исследования и их обсуждение
Полученные данные представлены в таблице и на рисунке в виде медиан и межквартильного размаха значений интенсивности ЛЗХЛ сыворотки крови для животных указанных экспериментальных групп.
Интенсивность ЛЗХЛ сыворотки крови, индуцированной перекисью водорода, при введении крысам питьевой воды с варьирующим содержанием дейтерия
|
Содержание дейтерия в питьевой воде |
Длительность эксперимента |
|||
|
1 мес. |
2 мес. |
6 мес. |
12 мес. |
|
|
10 мг/л |
6,21 [5,72; 6,38] p < 0,022 * |
6,25 [5,88; 6,40] p < 0,97 |
5,29 [5,12; 5,78] p < 0,003 * |
6,04 [5,58; 6,31] p < 0,029 * |
|
30 мг/л |
6,30 [6,16; 6,43] p < 0,043 * |
6,09 [5,90; 6,20] p < 0,97 |
5,63 [5,28; 6,21] p < 0,075 |
5,89 [5,79; 6,09] p < 0,0005 * |
|
60 мг/л |
6,44 [6,25; 6,48] p < 0,22 |
6,14 [6,07; 6,31] p < 0,90 |
5,57 [5,33; 5,74] p < 0,007 * |
5,78 [5,41; 6,33] p < 0,10 |
|
90 мг/л |
6,21 [6,19; 6,47] p < 0,063 |
6,30 [6,03; 6,39] p < 0,58 |
5,71 [5,01; 5,88] p < 0,043 * |
5,79 [5,59; 5,96] p < 0,001 * |
|
145 мг/л |
6,50 [6,47; 6,66] |
6,31 [5,78; 6,42] |
5,97 [5,84; 6,34] |
5,47 [5,46; 5;52] |
|
250 мг/л |
6,48 [6,40; 6,51] p < 0,44 |
6,41 [6,04; 6,68] p < 0,25 |
5,93 [5,73; 6,16] p < 0,58 |
5,78 [5,64; 5,98] p < 0,01 * |
|
1000 мг/л |
6,39 [6,09; 6,45] p < 0,05 * |
6,28 [6,13; 6,32] p < 0,74 |
5,54 [5,46; 5,97] p < 0,063 |
6,07 [5,56; 6,56] p < 0,001 * |
Примечания:
– интенсивность ЛЗХЛ сыворотки выражена в виде десятичных логарифмов светосуммы хемилюминесцентного сигнала за одну минуту.
– среднегрупповые данные представлены в виде медианы (Mе) и квартилей [Q1; Q3].
– достоверность различий рассчитана по отношению к значениям показателя в контрольной группе животных, получавшей питьевую воду с содержанием дейтерия 145 мг/л.
Как это видно из таблицы, уже на срок 1 мес. после начала эксперимента наблюдалось небольшое, но достоверное снижение интенсивности ЛЗХЛ сыворотки у крыс, получавших питьевую воду с низким (10 и 30 мг/л) и максимальным (1000 мг/л) содержанием дейтерия. Снижение интенсивности хемилюминесцентных сигналов на ранних сроках хронических экспериментов обычно связывают с адаптивным увеличением активности антиоксидантных ферментов. Через 2 мес. после начала опыта среднегрупповые значения показателя не отличались от контроля.
На срок 6 мес. снижение интенсивности ЛЗХЛ сыворотки выявлено почти у всех животных, получавших питьевую воду с пониженными концентрациями дейтерия: в трех группах крыс (10, 60 и 90 мг/л) достоверное, в 4-й (30 мг/л) – близкое к достоверному (р = 0,075). На грани достоверного эффекта находилось также снижение интенсивности ЛЗХЛ сыворотки у крыс, получавших воду с содержанием дейтерия 1000 мг/л (р = 0,063).
На срок 12 мес., к окончанию хронического эксперимента, достоверные различия с контролем были зарегистрированы во всех экспериментальных группах крыс, кроме группы «60 мг/л» (р = 0,10). При этом направление эффектов, по сравнению с более ранними сроками, изменилось на противоположное, в сторону увеличения амплитуды хемилюминесцентных сигналов и усиления скорости свободнорадикальных реакций по сравнению с контролем (рисунок).
Интенсивность ЛЗХЛ сыворотки крови у крыс, получавших питьевую воду с пониженным и повышенным содержанием дейтерия: А – через 6 мес. после начала опыта; Б – через 12 мес. после начала опыта
В целом полученные нами данные свидетельствуют о том, что на ранние сроки эксперимента достоверные изменения показателей окислительного стресса наблюдаются только в группах крыс, получавших воду с очень низким (10 и 30 мг/л) или очень высоким (1000 мг/л) содержанием дейтерия, причем эти изменения носят адаптивный характер и на сроке 2 мес. исчезают. В сходном исследовании Olariu et al. [10] (крысы Wistar, 150 и 30 мг/л дейтерия в питьевой воде, точки отбора крови 1 и 2 мес.) достоверные эффекты «легкой воды» на показатели окислительного стресса в пробах крови крыс наблюдались на оба срока опыта, однако последствия более длительного воздействия ни в этой, ни в других опубликованных работах не изучались. Как показал проведенный нами эксперимент, через 6 мес. непрерывного потребления питьевых вод с пониженным и повышенным содержанием дейтерия возвращаются адаптивные изменения интенсивности ЛЗХЛ сыворотки, характерные для раннего срока 1 мес., а через 12 мес. адаптивные изменения сменяются признаками нескомпенсированного окислительного стресса, наиболее выраженного в краевых точках содержания дейтерия в воде (10 и 1000 мг/л).
Заключение
Полученные данные свидетельствуют о том, что на выраженность изменений интенсивности ЛЗХЛ сыворотки крови крыс при введении им питьевой воды с пониженным и повышенным содержанием дейтерия влияли два параметра – содержание дейтерия в воде и время, прошедшее от начала эксперимента. Выявленные эффекты в основном носили адаптивный характер; признаки повреждения проявлялись только на срок 12 мес. после начала опыта. Наиболее выраженным действием обладали образцы воды с экстремальными концентрациями дейтерия (10 и 1000 мг/л).