Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Глиобластома (ГБ) является самой распространенной первичной злокачественной опухолью ЦНС: в данной нозологической группе её доля составляет 46,1 % [1]. Мы живем в эпоху таргетной терапии, когда терапевтические агенты, прецизионно нацеленные на ключевые драйверные молекулярные факторы опухолевых клеток, дают возможность преобразить клиническое течение и прогноз пациентов при многих злокачественных опухолях. Таргетная терапия, основанная на оценке межопухолевой молекулярно-генетической гетерогенности, стала поистине революционным веянием во многих областях онкологии [2]. Тем не менее в отношении ГБ подобный подход не работает – многочисленные разработки препаратов таргетной терапии ГБ не увенчались успехом [3]. Важнейшей причиной подобных неудач и ключом к созданию новых, эффективных диагностических и лечебных инструментов является внутриопухолевая гетерогенность ГБ. Наличие в рамках одной и той же опухоли клеточных популяций с различными молекулярными свойствами и драйверными факторами ограничивает эффективность традиционно применяемых подходов к разработке препаратов таргетной терапии [4]. Поэтому более глубокое понимание особенностей внутриопухолевой гетерогенности ГБ необходимо для создания более действенных средств лечения данной высокозлокачественной опухоли.

Несмотря на несомненную важность поставленной проблемы, исследований, посвященных внутриопухолевой гетерогенности ГБ, не так много. На сегодняшний день классическим для изучения внутриопухолевой гетерогенности при различных локализациях онкологического процесса стал метод single-cell ДНК и РНК секвенирования. Данная технология позволяет дифференцированно оценивать молекулярные свойства каждой опухолевой клетки, а полученный массив данных подвергнуть кластерному анализу с целью выделения различных клеточных популяций в рамках каждой отдельно взятой опухоли. Не так давно данный подход был применен и для оценки внутриопухолевой гетерогенности в ГБ. Neftel с коллегами показали, что злокачественные клетки в ГБ могут быть классифицированы на 4 молекулярных подтипа или молекулярных состояния: клетки, подобные нейрональным предшественникам (NPC), клетки, подобные олигодендрогиальным предшественникам (OPC), клетки, подобные астроцитарным предшественникам (AC), и мезенхимоподобные клетки (MES). Хотя каждый образец ГБ содержит клетки в нескольких состояниях, относительная частота каждого состояния или подтипа варьируется между опухолями. Также авторы показали, что для каждого подтипа характерны некоторые драйверные генетические изменения. В частности, NPC характеризуется амплификацией гена CDK4, для OPC типично наличие амплификации гена PDGFRA, амплификация гена EGFR наиболее часто встречается в AC, в то время как для MES ключевым драйверным молекулярным событием является инактивирующая мутация гена NF1 [5].

Методологический подход, примененный Neftel с коллегами, является мощным инструментом для оценки внутриопухолевой гетерогенности, генерирующим большое количество генетических данных высокого качества на уровне одной клетки. Однако данный подход не лишен недостатков, так как он не позволяет оценить топографическое распределение описанных клеточных популяций в ткани опухоли. Его применение предполагает лизирование образца с получением однородного в гистологическом отношении массива клеток, что исключает возможность изучения взаимоотношений популяций опухолевых клеток с ключевыми гистологическими детерминантами и тканевыми нишами, а также межпопуляционных взаимодействий. Это ограничивает применимость полученных результатов как в фундаментальной, так и в практической плоскости.

Мы попытались решить данную проблему, используя разрабатываемые нами авторские методики кластерного анализа комплексных изображений опухолей. На основе оценки пролиферативной и антиапоптозной активности опухолевых клеток, а также их топографического положения как в образце ткани в целом, так и относительно ключевых гистологических детерминант – некрозов и сосудов, нам удалось выделить пять кластеров в ГБ: перинекротический кластер (ПНК), непосредственно окружающий зону некрозов; транзиторный некротический кластер (ТНК), расположенный вокруг ПНК; периваскулярный кластер (ПВК), окружающий сосудистую стенку; транзиторный васкулярный кластер (ТВК), расположенный вокруг ПВК; промежуточный кластер (ПК), занимающий промежуточное положение между четырьмя другими кластерами [6].

При этом выяснилось, что наибольшая активность наблюдается в ПВК, отличающиеся в том числе самой высокой пролиферативной активностью. Наименее пролиферативно активным был ПНК, при этом соседний ТНК характеризовался относительно высокой пролиферативной активностью. ТНК отличался низкой пролиферативной активностью, в то время как для ПК были характерны средние значения всех показателей [6].

В настоящей работе мы решили оценить распределение ключевых популяций опухолевых клеток – NPC, OPC, AC и MES – в выделенных нами ранее клеточных кластерах ГБ. Для этой цели, используя методики флуоресцентной гибридизации in situ, мы оценили пространственную гетерогенность экспрессии матричных РНК (мРНК) генов CDK4, EGFR, PDGFRA и NF1 в образцах ГБ и провели раздельный подсчет активности экспрессии (АЭ) данных факторов в различных кластерах опухоли. Также мы оценили влияние показателей АЭ раздельно в каждом кластере на прогноз пациентов.

Материалы и методы исследования

Общая характеристика исследованной группы

В ретроспективное исследование были включены 50 образцов опухолей от пациентов с установленным диагнозом глиобластомы без мутаций в генах IDH1 и IDH2 (WHO Grade IV), проходивших хирургическое лечение в ФГАУ НМИЦ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко в 2012–2014 гг. Мутационный статус генов IDH1 и IDH2 определялся методами прямого секвенирования и полимеразной цепной реакции с ДНК зондами. Все пациенты, включенные в исследование, находились под динамическим наблюдением онколога или радиолога в течение минимум 5 лет и получали стандартные схемы химиотерапии и лучевой терапии. Критериями исключения были мультифокальный рост опухоли, облучение всего мозга, неполное лечение темозоламидом. Показатели общей выживаемости были рассчитаны в днях.

Проведение иммуногистохимического исследования

Из парафиновых блоков с фиксированными в них образцами опухолей изготавливали срезы толщиной 3 микрометра, депарафинировали с использованием ксилола и повторно гидратировали с помощью различных концентраций этанола, срезы высушивали в термостате при 45 °C. Затем срезы последовательно инкубировали с кроличьими моноклональными антителами против антигена Ki-67 человека (CONFIRM anti-Ki67, «Roche-Ventana»), мышиными моноклональными антителами против антигена человека Bcl-2 (CONFIRM anti-bcl-2, «Roche-Ventana»), мышиными моноклональными антителами против антигена человека BCL6 (клон GI191E/A8, Cell Marque, «Sigma-Aldrich», США) и после этого конъюгировали с антикроличьими мышиными (в случае с Ki-67) и антимышиными кроличьими (в случае Bcl-2 и BCL6) IgG антителами против пероксидазы хрена. Сайты связывания антител визуализировали с использованием тетрагидрохлорида 3,3’-диаминобензидина («Ventana Medical Systems», США), ядра клеток окрашивали гематоксилином.

Получение и первичный анализ изображений

Затем препараты подвергались оцифровке с использованием сканера Aperio AT2 (Leica Biosystems, GmbH). Изображения для всех маркеров (Ki-67, Bcl-2, BCL6) в формате SVS максимально точно сопоставлялись друг с другом по координатным данным с получением сложных комплексных изображений с помощью программного обеспечения Aperio ImageScope (Leica Biosystems, GmbH), ImageJ (Национальный институт здравоохранения, США) и QuPath (University of Edinburgh, Division of Pathology, Великобритания). Комплексные изображения модифицировались в отношении цветового диапазона с помощью медианной фильтрации с использованием программного обеспечения ImageJ, Adobe Photoshop (Adobe Systems, США) и QuPath. Далее применялось нерезкое маскирование для всех изображений с использованием Aperio ImageScope, ImageJ и QuPath. С применением программных алгоритмов под контролем оператора определялись границы сосудов и некрозов в образцах опухолей. Затем проводился кластерный анализ комплексных изображений с использованием программного обеспечения Matlab (The MathWorks, США) и SPSS Statistics 23 (IBM, США). Для этих целей применялся метод k-средних. В качестве исходного алгоритма кластеризации применялся ранее использованный алгоритм, основанный на определении для каждого пикселя в изображении показателей в семивекторной системе, учитывающей координатное положение пикселя, расстояние пикселя до края сосуда и некроза, значения показателей цветности по шкале RGB. Показатели цветности подсчитывались и интерпретировались по разработанной и описанной нами ранее методике [7]. Применяя данный алгоритм, проводили определение пяти ранее описанных кластеров в каждом образце опухоли.

Флуоресцентная гибридизация in situ с РНК-зондами

Парафиновые срезы тканей опухолей были фиксированы на предметных стеклах и хранились при 80 °С. Предметные стекла помещали в термостат и хранили там в течение 1 ч при температуре 60 °С, депарафинизировали и дегидратировали ксилолом и этанолом. Ткань предварительно обрабатывали перекисью водорода RNAscope Hydrogen Peroxide (Advanced Cell Technologies, США) в течение 10 мин при комнатной температуре и RNAscope Target Retrieval Reagent (Advanced Cell Technologies, США) в течение 15 мин при 98 °С. RNAscope Protease Plus (Advanced Cell Technologies, США) затем наносили на ткань и инкубировали в течение 30 мин при 40 °С. Гибридизационные зонды готовили разбавлением зонда С2 (красный) 1:50 в зонде С1 (зеленый). Использовались зонды-мишени для РНК EGFR, PDGFRA, CDK4 и NF1 (все Advanced Cell Technologies, США). Зонды добавляли к ткани и гибридизовали в течение 2 ч при 40 °С. Серия из 10 стадий амплификации была выполнена с использованием инструкций и реагентов, предоставленных в RNAscope 2.5 HD Duplex Detection Kit (Advanced Cell Technologies, США). Ткань подкрашивали гематоксилином в течение 25 с при комнатной температуре с последующим маунтингом с использованием среды VectaMount (Vector Laboratories, США).

Вторичный анализ флуоресцентных изображений при гибридизации in situ

Проводилась оцифровка препаратов, полученных методом флуоресцентной гибридизации in situ с применением сканера стекол Aperio VERSA (Leica Biosystems, GmbH) в флуоресцентном режиме. Далее с помощью программного обеспечения Matlab и SPSS Statistics 23 проводилось сопоставление данных изображений с комплексными изображениями, полученными на предыдущих этапах, с выделением кластеров в флуоресцентных изображениях. Далее как в препарате в целом, так и в выделенных кластерах раздельно проводился автоматически подсчет АЭ каждой мРНК во всех образцах по ранее описанной методике [7].

Статистический анализ

Для статистической обработки результатов применялось программное обеспечение SPSS Statistics 23. Проводилось сравнение средних значений АЭ мРНК между различными кластерами и оценка значимости различий с помощью U-критерия Манна-Уитни. Для выявления влияния АЭ мРНК в различных кластерах на прогноз пациентов применялась регрессия Кокса с подсчетом отношения рисков (ОР). Различия считали достоверными при p < 0,05 %.

Результаты исследования и их обсуждение

Общее описание исследованной группы

Средний возраст пациентов на момент операции составил 59,13 ± 2,96 года. Мужчины составляли 58 %, женщины – 42 %. Опухоли височной доли доминировали, они были обнаружены в 36 % случаев, за ними следовали опухоли лобной доли, что составило 24 % случаев, а затем – опухоли теменной доли с 22 % случаев, опухоли затылочной доли – 16 % и, наконец, 2 % опухолей имели стволовую локализацию. Общая пятилетняя выживаемость в группе пациентов составила 4 % (рис. 1).

Подсчет АЭ мРНК CDK4 в различных кластерах и межкластерные сравнения

Проводился раздельный подсчет АЭ мРНК CDK4 в каждом кластере с вычислением средних значений. АЭ CDK4 была наибольшей в ПВК и составила 73,52 ± 3,46 %. Далее по уровню АЭ CDK4 следовал соседний ТВК, в котором этот показатель составил 60,77 ± 1,35 %. Затем несколько меньшие значение были выявлены в ТНК, где АЭ CDK4 составила 47,87 ± 3,8 %. Далее расположились ПК – 46,5 ± 1,29 % и ПНК – 16,62 ± 1,25 % (рис. 2).

Рис. 1. Общая выживаемость исследованных пациентов с глиобластомой, кривая Каплан-Майер. По оси ординат – кумулятивная пропорция выживших пациентов, по оси абсцисс – время с момента постановки диагноза в днях

Рис. 2. Значения активности экспрессии (АЭ) матричных РНК CDK 4, EGFR, PDGFRA и NF1. По оси ординат обозначена АЭ в процентах, по оси абсцисс располагаются пять кластеров – перинекротический кластер (ПНК), транзиторный некротический кластер (ТНК), периваскулярный кластер (ПВК), транзиторный васкулярный кластер (ТВК), промежуточный кластер (ПК). Внутри каждого кластера проведен раздельный подсчет каждой мРНК (цветовые обозначения справа от графика)