Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Язвенный колит (ЯК) – хроническое рецидивирующее заболевание, характеризующееся диффузными воспалительными поражениями слизистой оболочки толстой кишки с развитием местных и системных осложнений [1]. Деструктивные изменения слизистой оболочки толстой кишки при ЯК обусловливают накопление на клеточных мембранах пула токсических соединений с высокой окислительной активностью [2]. Состояние мембраны эритроцита можно рассматривать в качестве доступной модели для установления общих мембранных характеристик [3] . Доказано, что под влиянием продуктов катаболического пула при ЯК активируются процессы перекисного окисления, приводя к дезорганизации белкового и фосфолипидного слоев мембраны [4]. На поверхности мембран увеличивается количество окисленных продуктов, в основном за счет гидроперекисей жирных кислот. Значительно увеличивается сорбционная способность эритроцита – показатель, отражающий целостность примембранного слоя [2].

В последнее время при лечении различных заболеваний в комплексной терапии используются антиоксиданты. Одним из представителей этой группы препаратов является отечественный препарат «Мексидол». Препарат усиливает активность мембраносвязанных ферментов и активно ингибирует свободнорадикальное окисление липидов биомембран [5]. Однако более детального анализа молекулярных механизмов действия данного препарата на клеточные мембраны в настоящее время не существует.

Показано, что мексидол способен оказывать влияние на некоторые липидные компоненты мембраны эритроцитов при ЯК [6]. Однако данных о количественном изменении содержания белков цитоплазматической мембраны клеток красной крови под воздействием мексидола мы не обнаружили, что и легло в основу нашего исследования.

Цель исследования: сравнить уровень содержания основных белковых компонентов мембраны эритроцитов у здоровых лиц и пациентов с ЯК, а также оценить влияние препарата «Мексидол» на состояние белков цитоплазматической мембраны красных клеток крови in vitro при ЯК.

Материалы и методы исследования

Исследование выполнено с соблюдением этических принципов медицинских исследований с участием человека, изложенных в Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации. Получено одобрение Комитета по биомедицинской этике ФГБУ НЦРВХ (протокол № 9 от 9.11.2012). Обследован 51 пациент с ЯК в период острой атаки, мужчины и женщины. Средний возраст пациентов 38,7 ± 1,9 лет, средняя длительность заболевания 5,7 ± 0,9 лет. Группу сравнения составили 30 клинически здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту. В обеих группах проводили забор периферической венозной крови из локтевой вены в пробирку с гепарином. Затем осаждали эритроцитарную массу, отмывая ее 3 раза от сыворотки. Для получения препаратов мембран эритроциты разрушали осмотическим шоком по методу Dodge [7].

Все операции по выделению и очистке водорастворимой фракции белков проводили в холодной комнате (–5 °С). Замороженные в жидком азоте мембраны гомогенизировали с добавлением фенилметилсульфонилфторида (PMSF) в 0.1 М Трис-HCl-буфере с 0.1 % додецилсульфатом натрия (SDS) (pH 7.6). Полученный экстракт центрифугировали при 15000g. Суммарный белок осаждали четырехкратным объемом ацетона и растворяли в 0.5 М Tрис-HCl-буфере (pH 6.8). Концентрацию общего белка определяли с использованием набора Qubit Protein Assay Kit (Invitrogen, США) на приборе Qubit согласно инструкции фирмы изготовителя.

Электрофорез проводили по методу Лэммли [8] в полиакриламидном геле (ПААГ) с концентрацией разделяющего геля 7.5 и 15 % в присутствии SDS с использованием аппаратуры и реактивов фирмы Bio-Rad. На дорожки наносили по 10 мкг суммарного белка. Гели окрашивали раствором Кумасси R-250 (Sigma, США). Для определения вида белка на электрофореграмме набор маркеров фирмы Thermoscientific (#26614). В результате анализа 324 электрофореграмм (7,5 и 15 % ПААГ) оценивали уровень (у.е.) 10 мембранных белков эритроцитов, из них структурные белки – α-спектрин, β-спектрин, анкирин, актин и тропомиозин, функциональные белки – анион-транспортный белок (АТБ), белок полосы 4.1, транспортер глюкозы, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (Г-3-ФДГ) и глутатион-S-трансфераза. Содержание белков в каждой полосе определяли по уровню максимальной интенсивности окраски Кумасси R-250, с применением компьютерной программы [9].

Статистическую обработку проводили с помощью пакета программ «Statistica 10.0». Данные в сравниваемых группах анализировали с помощью непараметрического U-критерия Манна–Уитни (для независимых переменных) и критерия Вилкоксона (для зависимых переменных). Различия считали статистически значимыми при р < 0,05. Характер различий групповых переменных исследовали с использованием дискриминантного анализа и корреляционного анализа по Спирману.

Результаты исследования и их обсуждения

При сравнительном анализе 10 структурных белков цитоплазматической мембраны у больных ЯК было обнаружено их достоверное снижение, в сравнении с группой клинически здоровых лиц (табл. 1(1–3)).

Для того чтобы понять, какие из изучаемых нами белков наиболее существенно дискриминировали группы здоровых лиц и пациентов с ЯК, мы провели дискриминантный анализ между этими группами. В результате было выявлено, что в разделение группы здоровых лиц и пациентов с ЯК наибольший вклад вносили следующие белки: актин, тропомиозин, транспортер глюкозы и глутатион–S–трансфераза. Установлено, что они на 93 % дискриминировали исследуемые группы (рис. 1). Причем наиболее существенный вклад в эту дискриминацию вносили белки актин (ƛ  = 0,632) и тропомиозин (ƛ  = 0,708). При этом уравнение канонических значений выглядело следующим образом.

Поскольку нас интересовало, какое влияние оказывает мексидол на содержание белковых компонентов в мембране красных клеток крови, мы сравнивали изучаемые параметры не только в группах здоровых и больных ЯК, но также и в подгруппах с инкубацией эритроцитов в физиологическом растворе (NaCl) и растворе мексидола. Было обнаружено, что мексидол не оказывал существенного влияния на содержание белков в мембране эритроцитов у клинически здоровых людей (табл. 1 (3–4)). При воздействии мексидола на эритроциты у больных ЯК уровень изучаемых белков цитоплазматической мембраны оставался ниже, чем в группе здоровых людей (табл. 1 (2–4)). Однако в сравнении с инкубацией в растворе NaCl у этой группы пациентов, было установлено достоверное увеличение в мембране содержания трех белков: актин, Г-3-ФДГ и тропомиозин (табл. 1 (1–2)).

Таблица 1

Содержание белковых компонентов (у.е) мембраны эритроцитов у больных язвенным колитом и здоровых лиц. Me (Q25:Q75)

Примечание. Для всех переменных Р1,3 и Р2,4 < 0,05 (критерий Манн – Уитни); * Р1,2 < 0,05 (критерий Вилкоксона).

К = 1,536 + 5,827·тр.глюкозы – 7,489·актин + 1,607·тропомиозин – 2,505·гл.–S–тр-за

Рис. 1. Диаграмма распределения здоровых лиц и больных ЯК с инкубацией эритроцитов в физиологическом растворе по данным дискриминантной функции белков мембраны эритроцитов и канонического анализа

Учитывая тот факт, что эритроцит не имеет внутриклеточных образований, способных синтезировать белки, вероятно, увеличение уровня данных белков при инкубации красных клеток крови в растворе мексидола происходит за счет снижения уровня других, не изученных нами, белковых компонентов цитоплазматической мембраны.

Как известно, фермент Г-3-ФДГ принимает участие в выработке энергии, которая в свою очередь необходима для функционирования структурных белков, таких как актин и тропомиозин. Таким образом, увеличение количества этих трех белков после инкубации красных клеток крови пациентов с ЯК в растворе мексидола можно рассматривать как положительное действие данного лекарственного средства на мембрану эритроцита в условиях исследуемой патологии.

Далее мы выявили, что в разделение групп здоровых лиц и пациентов с ЯК с инкубацией эритроцитов в растворе мексидола наибольший вклад вносили три белка: анионтранспортный белкок, транспортер глюкозы и также глутатион–S–трансфераза. Они дискриминировали данные группы на 90 % (рис. 2). Наибольший вклад в разделение этих групп вносил АТБ (ƛ = 0,58). Уравнение канонических значений для дискриминации групп с инкубацией эритроцитов в мексидоле выглядело следующим образом (рис. 2).

Для лучшего понимания взаимодействия структурных и функциональных белков мембраны эритоцитов при ЯК и воздействии мексидола на этот процесс, мы провели корреляционный анализ по Спирману. В группе контроля (здоровые люди) была выявлена корреляционная связь следующих белков: транспортер глюкозы, АТБ и Г-3-ФДГ со всеми изучаемыми структурными белками, за исключением тропомиозина (табл. 2). Наиболее тесная корреляция наблюдалась между актином и транспортером глюкозы (R = 0,82), а также между актином и Г-3-ФДГ (R = 0,89). Кроме этого в данной группе была выявлена корреляция Гл.-S-трансферазы с актином (R = 0,46) и тропомиозином (R = 0,65). После инкубации эритроцитов здоровых лиц в растворе мексидола выявленные корреляционные связи сохранялись, за исключением взаимодействия Г-3-ФДГ с а-спектрином и Гл.-S-трансферазой с актином (табл. 2). Следует отметить, что воздействие мексидола приводило к более тесной корреляции между актином и АТБ, транспортером глюкозы и анкирином, но снижало взаимодействие между Г-3-ФДГ и актином.

Анализ взаимосвязи функциональных и структурных белков в группе больных ЯК с инкубацией клеток в растворе NaCl показал корреляции изучаемых функциональных белков только с двумя структурными белками: актин и тропомиозин (табл. 3). После инкубациеи эритроцитов в растворе мексидола в группе пациентов с ЯК сохранялись те же корреляционные связи белков, что и при инкубации в физиологическом растворе (табл. 3). Воздействие мексидола в этой группе усиливало связи между актином и АТБ, транспортером глюкозы и актином, но существенно снижало взаимодействие Г-3-ФДГ с актином и тропомиозином.

К = 2,047 – 9,849·АТБ + 12,249·тр.глюкозы – 3,436· гл.–S–тр-за

Рис. 2. Диаграмма распределения здоровых лиц и больных ЯК с инкубяцией эритроцитов в растворе мексидола по данным дискриминантной функции белков мембраны эритроцитов и канонического анализа

Таблица 2

Характер корреляционных связей между структурными и интегральными белковыми компонентами цитоплазматической мембраны у клинически здоровых лиц