Буккальный эпителий является традиционным объектом цитологического исследования, преимуществом которого является неинвазивное для исследуемого взятие материала с приготовлением мазков и отпечатков. Он играет важную роль в диагностике социально значимых заболеваний [1, 2]. Буккальные эпителиоциты могут быть индикатором местных и общих нарушений гомеостаза у взрослых и детей [3–5]. Для идентификации стадий дифференцировки буккальных эпителиоцитов необходимо учитывать их характерные цитологические особенности: форму и размеры клеток, интенсивность окраски цитоплазмы и ядра. Находит применение морфометрическое исследование площадей ядра и цитоплазмы, определение ядерно-цитоплазматического отношения, денситометрическое иследование клеток для дифференцировки эпителиоцитов. Этот метод основан на избирательном поглощении различными веществами лучей со строго определенной длиной волны. Интенсивность поглощения света зависит от концентрации вещества. Наши исследования показали, что у детей при оптической плотности ядра от 0,004 усл. ед. и ниже в основном встречаются эпителиоциты 3-й стадии развития, оптической плотности от 0,06 до 0,10 усл. ед. содержатся клетки 4-й стадии. И при эначениях показателя от 0,14 и выше олределяются клетки 5-й стадии дифференцировки [6, 7].
Цель исследования: изучение и сопоставление денситометрических параметров оптической плотности ядра и оптической плотности содержания гликогена в цитоплазме эпителиоцитов разной стадии дифференцировки у детей различного возраста.
Материалы и методы исследования
В период первого детства (от 4 до 7 лет) было обследовано 56 здоровых детей, во втором детстве изучены мазки 67 детей. В пубертатный период (13–16 лет) исследование проведено на 39 подростках. До забора материала дети прополаскивали ротовую полость физиологическим раствором. Соскоб эпителия получали пластиковым шпателем со слизистой щеки. Мазки эпителия переносили на предметные стёкла, высушивали и фиксировали в спиртацетоне (1:1) в течение 5 мин окрашивали метиленовым синим (15 мин), затем азурэозином в течение 30 мин. Для изучения содержания в цитоплазме клеток гликогена мазки окрашивались шифф-реактивом. В мазках определяли в процентах клетки различных стадий дифференцировки на 1000 клеток. Для морфоденситометрического исследования использован комплекс: микроскоп, видеокамера и компьютер. В каждой возрастной группе получали черно-белые изображения эпителиоцитов каждой стадии дифференцировки в формате JPG. Всего цитометрическому и денситометрическому исследованиям подвергнуто более 10000 эпителиальных клеток. Затем определяли площади клеток, их ядер в мкм2 и ядерно-цитоплазматическое отношение. Затем денситометрически исследовали среднюю плотность и содержание гликогена в цитоплазме. Для изучения тинкториальных свойств ядер эпителиоцитов разной стадии дифференцировки определяли оптическую плотность интерфазного ядра. Статистический анализ полученных данных проводили с помощью профессионального пакета статистических программ Statsoft «Statistica-6», методами вариационной статистики. При корреляционном анализе применяли коэффициент корреляции Пирсона.
Результаты исследования и их обсуждение
Среди буккальных эпителиоцитов во всех возрастных группах детей в норме в соскобе различают клетки 3-й, 4-й, 5-й и 6-й стадий дифференцировки. Они отличаются процентным содержанием, формой, размерами, площадью ядра и цитоплазмы.
В период первого детства содержание клеток 3-й стадии дифференцировки в цитограмме незначительно и составляет 2,7 ± 0,53 %, Число эпителиоцитов 4-й стадии равно 31,1 ± 1,70, клеток 5-й стадии превалирует и составляет 58, ± 2,35. С повышением степени кератинизации поверхностные клетки превращаются в безъядерные – 6-й стадии дифференцировки. Процент клеток 6-й стадии в цитограмме равен 2,1 ± 0,27. Ядерно-цитоплазматическое отношение эпителиоцитов 3-й стадии равняется 0,05 ± 0,001. Оптическая плотность ядер составляет 0,03 ± 0,001усл. ед.
В клетках 3 стадии дифференцировки содержится большое количество гранул гликогена, которые заполняют всю цитоплазму, окрашивая её в пурпурный цвет. Наблюдается тенденция к формированию конгломератов. Средняя оптическая плотность гликогена в клетках равна 0,244 ± 0,0197 усл. ед. Ядерноцитоплазматическое отношение эпителиоцитов 4-й стадии равняется 0,04 ± 0,001. Оптическая плотность ядер составляет 0,08 ± 0,002 усл. ед. Цитоплазма клеток 4-й стадии сохраняет положительную реакцию на гликоген, но интенсивность окраски по сравнению с клетками 3-й стадии уменьшается, гранулы гликогена диффузно рассеяны по всей цитоплазме. Оптическая плотность гликогена клеток 4-й стадии дифференцировки существенно уменьшается (р < 0,001) и имеет значение 0,07 ± 0,009 усл. ед. Ядерно цитоплазматическое отношение эпителиоцитов 5-й стадии равняется 0,03 ± 0,001.
Фрагмент мазка щеки здорового ребёнка. ШИК-реакция, ×630. Гликоген в эпителиоцитах: а – 3-й, в – 4-й, с – 5-й, d – 6-й – стадий дифференцировки
Денситометрические показатели буккальных эпителиоцитов у детей разного возраста
|
Стадии эпителиоцитов |
Возраст детей |
ЯЦО |
оптическая плотность ядра |
оптическая плотность гликогена |
|
3 |
первое детство |
0,05 ± 0,001 |
0,03 ± 0,001 |
0,24 ± 0,019 |
|
второе детство |
0,05 ± 0,001 |
0,03 ± 0,003 |
0,21 ± 0,015 |
|
|
подростки |
0,05 ± 0,001 |
0,03 ± 0,002 |
0,19 ± 0,011 |
|
|
4 |
первое детство |
0,04 ± 0,001* |
0,08 ± 0,002* |
0,07 ± 0,009* |
|
второе детство |
0,04 ± 0,001* |
0,08 ± 0,002* |
0,06 ± 0,008* |
|
|
подростки |
0,04 ± 0,001* |
0,08 ± 0,002* |
0,05 ± 0,003* |
|
|
5 |
первое детство |
0,03 ± 0,001* |
0,18 ± 0,004* |
0,03 ± 0,004* |
|
второе детство |
0,03 ± 0,001* |
0,19 ± 0,004* |
0,02 ± 0,005* |
|
|
подростки |
0,03 ± 0,001* |
0,17 ± 0,003* |
0,02 ± 0,005* |
|
|
6 |
первое детство |
0,01 ± 0,002* |
||
|
второе детство |
0,01 ± 0,002 |
|||
|
подростки |
0,01 ± 0,001 |
Оптическая плотность ядер составляет 0,18 ± 0,004 усл. ед. Гликоген в эпителиальных клетках 5-й стадии дифференцировки выявляется в незначительном количестве, цитоплазма имеет бледнорозовый цвет. Средний денситометрический показатель гликогена в эпителиоцитах 5-й стадии равен 0,03 ± 0,004 усл.ед., интенсивность окрашивания по сравнению с предшествующей стадией продолжает снижаться (р < 0,01). Безъядерные пластинки бедны гликогеном, а некоторые клетки лишены его (рисунок). Средняя оптическая плотность гликогена в роговых чешуйках равна 0,01 ± 0,002 усл. ед. это минимальный показатель из всех стадий дифференцировки (р < 0,001). Анализ средней оптической плотности гликогена показывает, что в процессе дифференцировки эпителиоцитов чётко прослеживается снижение содержания гликогена в клетке (р < 0,001).
В период второго детства количество клеток 3-й стадии дифференцировки в цитограмме невелико (2,5 ± 0,46 %), доля эпителиоцитов 4-й стадии дифференцировки равняется 24,0 ± 1,83 %, клетки 5-й стадии составляют 64,4 ± 2,87 %. Процент безъядерных пластинок в цитограмме равен 2,5 ± 0,09 %. Ядерно-цитоплазматическое отношение эпителиоцитов 3-й стадии равняется 0,05 ± 0,001.
Оптическая плотность ядер составляет 0,03 ± 0,003 усл. ед. Средний денситометрический показатель гликогена в клетках 3-й стадии равен 0,21 ± 0,015 усл. ед. Показатели не имеют существенной разницы при сравнении с детьми 3–7 лет. Ядерно-цитоплазматическое отношение эпителиоцитов 4-й стадии равняется 0,04 ± 0,001. Оптическая плотность ядер составляет 0,08 ± 0,002 усл. ед. Денситометрический параметр гликогена клеток 4-й стадии в сравнении с 3-й стадией дифференцировки значимо снижается (р < 0,001) и имеет значение 0,06 ± 0,008 усл. ед., при этом достоверно не изменяясь с предыдущим возрастным периодом Ядерно-цитоплазматическое отношение эпителиоцитов 5-й стадии равняется 0,03 ± 0,001. Оптическая плотность ядер составляет 0,19 ± 0,004 усл. ед. Средний денситометрический показатель гликогена в эпителиоцитах 5-й стадии равен 0,02 ± 0,005 усл. ед. Интенсивность окрашивания в клетках по сравнению с предшествующей стадией дифференцировки и предшествующим периодом детства снижается (р < 0,05).
Средняя оптическая плотность гликогена в роговых чешуйках равна 0,01 ± 0,002 усл. ед. без достоверной разницы между клетками 5-й стадии дифференцировки и безъядерными пластинками периода первого детства.
У подростков содержание клеток 3-й стадии дифференцировки в цитограмме незначительно и составляет 1,9 ± 0,48 %, Число эпителиоцитов 4-й стадии равно 19,4 ± 1,47, клеток 5-й стадии превалирует и составляет 69,8 ± 3,12. Процент клеток 6-й стадии в цитограмме равен 4,9 ± 0,47.
Ядерно-цитоплазматическое отношение эпителиоцитов 3-й стадии равняется 0,05 ± 0,001. Оптическая плотность ядер составляет 0,03 ± 0,002 усл. ед. Эпителиоциты при гистохимической реакции на гликоген визуально сохраняют тинкториальные свойства. Оптическая плотность гликогена в клетках 3-й стадии составляет 0,19 ± 0,011 усл. ед., что не имеет существенной разницы при сравнении с детьми 8–12 лет. Ядерно-цитоплазматическое отношение эпителиоцитов 4-й стадии равняется 0,04 ± 0,001. Оптическая плотность ядер составляет 0,08 ± 0,002 усл. ед. Оптическая плотность гликогена эпителиоцитов 4-й стадии в сравнении с 3-й стадией дифференцировки снижается (р < 0,001) и имеет значение 0,05 ± 0,003 усл. ед., при этом достоверно не изменяясь с предыдущим возрастным периодом.Ядерно-цитоплазматическое отношение эпителиоцитов 5-й стадии равняется 0,03 ± 0,001. Оптическая плотность ядер составляет 0,17 ± 0,003 усл. ед. Денситометрический показатель гликогена эпителиоцитов 5-й стадии равен 0,02 ± 0,005 усл. ед., что существенно не изменяется по сравнению с 3-й стадией и с периодом второго детства. Средняя оптическая плотность гликогена в роговых чешуйках равна 0,01 ± 0,001 усл. ед. без достоверной разницы между клетками 5-й стадии дифференцировки и безъядерными пластинками периода второго детства.
Заключение
Независимо от возраста ребёнка с увеличением степени дифференцировки эпителиоцитов в них уменьшаются показатели ядерно-цитоплазматического отношения, увеличивается показатель оптической плотности ядра, падает средняя оптическая плотность и среднее количество гликогена. Однако цитометрический способ по значениям ядерно-цитоплазматического значения не позволяет дифференцировать эпителиоциты 3-й и 4-й стадий. Денситометрический способ повышает качество диагностики стадий буккального эпителия.
Возрастные особенности заключаются в большем содержании среднего количества гликогена в цитоплазме клеток 3-й, 4-й и 5-й стадий дифференцировки в период первого детства и достоверно меньших значений площадей клеток и ядер эпителиоцитов всех стадий дифференцировки у подростков. Анализ корреляционных связей показал, что между стадией дифференцировки клеток и оптической плотностью ядер эпителиоцитов, между стадией дифференцировки клеток и оптической плотностью и содержанием гликогена, между оптической плотностью ядер и оптической плотностью гликогена в цитоплазме эпителиоцитов имеются прямые сильные связи. Таким образом, к критериям идентификации клеток эпителия полости рта наряду с визуальной оценкой следует отнести денситометрическое определение оптической плотности ядер эпителиоцитов и содержания в цитоплазме клеток гликогена.