Scientific journal
International Journal of Applied and fundamental research
ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,593

SEARCH FOR COMPOUNDS WITH ANALGESIC ACTIVITY USING MOLECULAR DOCKING IN STRUCTURE – ACTIVITY STUDIES ON CYCLOOXYGENASE 1 AND 2 ENZYMES IN A SERIES OF N-SUBSTITUTED ANTHRANILIC ACIDS

Andryukov K.V. 1 Korkodinova L.M. 1
1 Perm State Pharmaceutical Academy
This article is devoted to the use of molecular docking for the cyclooxygenase 1 and 2 enzyme in the study of the structure – activity relationship in a series of N-substituted anthranilic acids. When docking, the enzymes cyclooxygenase 1 (PDB ID code: 3N8X) and 2 (PDB ID code: 1PXX) were used, the structures of which were obtained from the RCSB Protein Data Bank database. Before molecular docking, optimization and quantum chemical calculation of the structures of the compounds under study was performed by the semi-empirical PM3 method using the Gaussian 03 program. Ligand – receptor interactions were modeled using the AutoDock 4.0 program as part of the MGL Tools 1.5.6 software package using the Lamarckian genetic algorithm. As a result of docking scoring functions: the binding energy (Binding energy (BeCOX1, BeCOX2)) and intermolecular energy (Intermolecular energy (ImeCOX1, ImeCOX2)) characterizing the interaction of the ligand with the receptor. Studies of the dependence of analgesic activity on scoring functions and physico-chemical descriptors have been performed. The structure – activity models were compiled by performing multiple linear regression analysis using the Statistica 6 program. Four correlation equations linking scoring functions and physicochemical descriptors with analgesic activity were compiled. The compiled models were tested using 3 compounds as an example. Thus, the obtained mathematical models can be used for screening for analgesic activity of compounds in a number of derivatives of anthranilic acid, which are planned to be synthesized.
аnthranilic acid
molecular docking
analgesic activity
quantum chemical parameters
structure – activity

Моделирование взаимодействия с организмом с целью проведения скрининга с использованием молекулярного докинга, и полученных на его основе соотношений «структура – активность» позволяет проводить целенаправленный поиск соединений с выбранным видом фармакологической активности. Использование молекулярного докинга возможно в том случае если известна мишень, с которой взаимодействует исследуемый лиганд. Перед проведением скрининга методом молекулярного докинга важно узнать фермент, воздействие на который приводит к появлению у исследуемого лиганда анализируемой биологической активности.

Антраниловая кислота принимает участие в широком спектре биохимических реакций, используется в качестве одного из ключевых реагентов в полусинтетическом методе получения ряда антибиотиков, как, например, кальцимицина, проявляющего противомикробную активность [1]. Производные антраниловой кислоты относятся к классу биологически активных соединений, обладающих широким спектром фармакологической активности: анальгетической [2], противовоспалительной и противомикробной [3–6].

Проведение моделирования по анальгетической активности является актуальным при проведении целенаправленного поиска веществ с выраженной анальгетической активностью. Сочетание молекулярного докинга с физико-химическими дескрипторами позволяет учитывать в проводимых исследованиях физико-химические свойства веществ, увеличивая качество модели, как, например, модель «структура – противовоспалительная активность» [7].

Цель исследования: исследование связи «структура – анальгетическая активность» с использованием молекулярного докинга по ферментам циклооксигеназа (ЦОГ) 1 и 2 в ряду N-замещенных антраниловых кислот (10 соединений)

andr1.wmf

R = CH2CH=C(Cl)CH3 (1);

R = CH2CH=CH2 (2);

R = COC6H3(2,4-Cl2) (3);

R = COCONHCH2CH=CH2 (4);

R = COCOOC2H5 (5);

R = CO(2-фурил) (6);

R = CO Ad (7);

R = CH2C6H5 (8);

R = COC6H4(2-OCH3) (9);

R = COCH2C6H5 (10)

Материалы и методы исследования

Структуры всех лигандов были построены и оптимизированы с использованием программы Gaussian 03 полуэмпирическим методом РМ3 с полной оптимизацией геометрии молекул, и затем были конвертированы в 3D-формат (.pdb) с помощью программы ChemBio3D Ultra 12,0.

Определение анальгетической активности (АА) проводили на беспородных белых мышах массой 18–23 г на модели «горячей пластинки». Исследуемые соединения вводили внутрь в дозе 50 мг/кг за 0,5 ч до помещения животных на металлическую пластинку, нагретую до 53,5 °С. Каждое соединение испытывали на пяти животных. Показателем изменения болевой чувствительности служила измеряемая в секундах длительность пребывания животных на горячей пластине до момента облизывания ими задних лапок [8].

Моделирование лиганд – рецепторных взаимодействий осуществляли программой AutoDock 4.0 в составе программного комплекса MGL Tools 1.5.6, с использованием Ламарковского генетического алгоритма, который позволяет воспроизводить строение комплексов более точно. При проведении молекулярного докинга мы использовали трёхмерные модели молекул фермента, информация о которых получена из базы данных RCSB Protein Data Bank ЦОГ 1 (PDB ID code: 3N8X [9]) и 2 (PDB ID code: 1PXX [10]). Изначально, все молекулы воды были удалены из структуры белка. Файлы рецептора и лигандов были конвертированы в формат PDBQT–файла, с добавлением недостающих атомов водорода и частичных атомных зарядов по методу Гастейгера.

В процедуре докинга, с координатами точек (60×60×60) вокруг каждого моделируемого участка, по ферменту ЦОГ 1 при построении Grid–карт за центр были взяты координаты лиганда (x = –19,44, y = –54,38, z = 6,07), а для фермента ЦОГ 2 координаты лиганда (x = 26,25, y = 25,04, z = 14,66). В результате получено 10 Grid–карт по параметрам для исследуемых соединений по ЦОГ 1 и 2. Оценку качества позиционирования характеризовали величиной RMSD, представляющей собой среднеквадратичное отклонение положения лиганда после докинга от его начального положения в белке.

Результаты исследования и их обсуждение

Структуры всех лигандов были построены и оптимизированы с использованием программы Gaussian 03 полуэмпирическим методом РМ3 с полной оптимизацией геометрии молекул. В результате получены квантово-химические дескрипторы: суммарные значения напряженности электрического поля Σ(Е), потенциала Σ(φ) и заряда Σ (|q|) на атомах углерода, кислорода, азота и водорода (табл. 1). Рассчитанные квантово-химические дескрипторы использовали для теоретического расчёта физико-химических дескрипторов исследуемых соединений с помощью зависимостей «структура – свойство»: констант липофильности (log Pрассч) [11], констант кислотности (pKaрассч) и основности (pKврассч) [12] (табл. 1).

Значения констант липофильности лежат в интервале от 0,44 (у соединения 5) до 2,92 (соединение 6). Константы кислотности, характеризующие ионизацию, рассчитанные значения которых находятся в пределах от 5,10 (соединение 3) до 7,89 (для соединения 4). Значения констант основности, в интервале от 11,91 у соединения 5 до 13,42, для соединения 3.

Для 10 соединений из ряда N-замещенных антраниловых кислот была экспериментально определена АА. Установлено, что большинство изучаемых амидов обладает различным уровнем АА от 13,5 до 27 с (табл. 2).

Моделирование лиганд-рецепторных взаимодействий осуществляли программой AutoDock 4.0 в составе программного комплекса MGL Tools 1.5.6, с использованием Ламарковского генетического алгоритма, который позволяет воспроизводить строение комплексов более точно.

В качестве активного сайта фермента ЦОГ 1 был принят участок макромолекулы, содержащий аминокислоты (SER530, TYR385, ARG120, TYR355, ALA527, MET113, LEU531, VAL116, VAL349, ILE523, PHE518, LEU352, PHE381, TRP387, LEU359, ALA527, ILE517, LEU384) [9] и ЦОГ 2 (VAL349, ALA527, TYR355, VAL523, LEU352, TRP387, PHE518, LEU384, TYR385, ARG120, SER530) [10]. Значимыми считали гидрофобные взаимодействия и образование межмолекулярных водородных связей с аминокислотами активного участка ферментов ЦОГ 1 и 2.

Результат проведенного молекулярного докинга по ферментам ЦОГ 1 и 2 представлен в табл. 2 виде скоринговых функций: энергия связывания (Binding energy (BeЦОГ1 и BeЦОГ2)) и межмолекулярная энергия (Intermolecular energy (ImeЦОГ1 и ImeЦОГ2)), характеризующие взаимодействие лиганда с рецептором.

Таблица 1

Квантово-химические дескрипторы N-замещенных антраниловых кислот

C(E)

N(E)

C(φ)

O(φ)

N(φ)

O(|q|)

logPрассч

pKaрассч

pKврассч

1

5,43

0,40

125,71

27,07

13,18

0,70

1,74

6,74

12,40

2

4,97

0,40

110,98

25,96

12,79

0,69

1,66

6,43

12,60

3

8,47

0,52

171,22

41,01

13,83

1,02

2,48

5,10

13,42

4

6,18

0,95

143,04

54,51

26,62

1,32

1,06

7,89

12,03

5

5,32

0,49

126,17

67,55

13,07

1,61

0,44

7,17

11,91

6

5,87

0,22

135,61

54,03

13,27

1,11

2,92

6,34

13,03

7

13,31

0,67

264,12

46,25

15,79

1,03

2,04

3,93

14,14

8

7,51

0,24

169,77

27,40

14,15

0,70

1,95

6,11

13,22

9

7,76

0,23

185,36

58,14

14,42

1,23

2,89

6,82

12,74

10

8,41

0,10

186,32

42,85

14,53

0,97

1,33

5,47

13,99

 

Таблица 2

ААэксп. и скоринговые функции по ЦОГ 1 и 2 N-замещенных антраниловых кислот

ААэксп., сек

Beцог1

Imeцог1

Beцог2

Imeцог2

1

27,0

–6,12

–7,61

–4,87

–6,36

2

23,0

–4,15

–6,44

–4,62

–6,11

3

17,3

–6,91

–8,10

–6,24

–7,43

4

16,2

–5,99

–7,78

–5,06

–6,85

5

13,5

–5,42

–7,21

–4,69

–6,48

6

17,0

–6,18

–7,38

–5,27

–6,46

7

17,1

–6,71

–7,91

–7,14

–8,33

8

14,6

–7,39

–8,89

–6,20

–7,69

9

17,6

–6,35

–7,85

–6,42

–7,74

10

22,8

–6,35

–7,84

–6,68

–8,17

 

С целью составления модели «структура – анальгетическая активность» проведен множественный линейный регрессионный анализ с использованием программы Statistica 6, зависимости ААэксп. от констант липофильности (logPрассч), ионизации (pKaрассч и pKврассч) и скоринговых функций по ферментам ЦОГ 1 и 2 (BeЦОГ1, BeЦОГ2, ImeЦОГ1, ImeЦОГ2).

Всего было сгенерировано свыше 23 уравнений регрессии методом пошагового включения параметров с использованием программы Statistica 6, из которых были отобраны четыре уравнения 1–4 (табл. 3).

Таблица 3

Уравнения множественной регрессии зависимости ААэксп. от logPрассч, pKврассч, BeЦОГ1, ImeЦОГ1, BeЦОГ2, ImeЦОГ2.

Уравнение регрессии

R

F

S

Q2LOO

1

ААрассч.1 = 43,689 – 3,519×BeЦОГ1 + 6,107×ImeЦОГ1

0,398

0,66

4,42

0

2

ААрассч.2 = –5,451 + 4,089×pKврассч + 4,784×BeЦОГ1

0,880

7,09

2,69

0,40

3

ААрассч.3 = 21,906 +2,649×pKврассч + 4,946×ImeCOX1

0,745

4,36

3,21

0,04

4

ААрассч.4 = –20,489 + 4,501×pKврассч + 7,190×BeЦОГ1 – 3,187×ImeЦОГ1

0,899

8,46

2,27

0,51

 

Таблица 4

log Pрассч, pKaрассч, pKврассч, скоринговые функции по ЦОГ 1 и 2, ААрассч.4, ААэксп. N-замещенных антраниловых кислот (10 соединений)

log Pрассч

pKaрассч

pKврассч

Beцог1

Imeцог1

Beцог2

Imeцог2

ААрассч.4

ААэксп.,сек

1

2,50

6,00

12,72

–6,95

–8,12

–6,54

–7,74

13,6

11,7

2

1,57

7,11

11,86

–5,10

–8,12

–6,15

–7,39

11,1

13,8

3

1,02

6,23

12,86

–5,63

–6,82

–4,99

–6,18

18,7

21,3

 

Установлено, что полученное уравнение 4 имеет наибольшие значения коэффициента корреляции (R), критерия Фишера (F) и минимальное значение среднеквадратичной ошибки (S). Проведена оценка составленных уравнений методом перекрестного контроля с выбором по одному (Leave-one-out Cross-validation, LOO) (Q2LOO), с использованием программы Statographics. Определен коэффициент детерминации предсказаний Q2LOO, показывающий значимость составленных уравнений. К наиболее значимым по рассчитанным критериям R, F, Q2LOO относится модель в виде уравнений 4.

Уравнение 4, апробировано для теоретического расчёта АА на трех примерах соединений 11 – 13 из ряда N-замещенных антраниловых кислот (табл. 4).

andr2.wmf

R = COC6H3(3-CH3) (11);

R = CO C6H4 (4-NO2) (12);

R = COCH2Cl (13)

Для проверки проведенного прогноза по соединениям 11–13, была экспериментально определена АА (ААэксп.) (табл. 4).

Оценку точности прогнозирования АА по полученному уравнению 2 проводили с использованием среднеквадратичной ошибки прогноза (Sпрогн.).

Заключение

Проведен теоретический расчёт физико-химических дескрипторов исследуемых соединений с использованием зависимостей «структура – свойство». Для 13 соединений из ряда N-замещенных антраниловых кислот была экспериментально определена АА.

Выполнены исследования взаимодействия анализируемых производных с ЦОГ 1 и 2 методом молекулярного докинга, в результате получены скоринговые функции BeЦОГ1, BeЦОГ2, ImeЦОГ1, ImeЦОГ2. Составлена модель «структура – анальгетическая активность». Проведена проверка полученной модели на трех соединениях. Для оценки качества прогноза рассчитано значение Sпрогн., которое равно 2,43. Полученный результат сопоставим со значением S по уравнению 4.

Таким образом, можно сделать вывод, что полученную модель в виде уравнения 4 можно использовать для прогнозирования АА N-замещенных производных антраниловых кислот.