Литературные данные, касающиеся изменения пигментных систем у различных представителей рода Dunaliellа под воздействием экстремальных условий существования сводятся к тому, что абсолютное содержание всех пигментов в клетках Dunaliellа при увеличении концентрации осмотически действующих солей, недостатке биогенных элементов, повышении и понижении температуры, как правило увеличивается [1]. Абсолютное содержание хлорофиллов а и в и их суммы в клетках всех видов, Dunaliella в экстремальных условиях существования имеет тенденцию уменьшаться.
Известно, что также в процессе роста культур содержание и соотношение пигментов в биомассе изменяется. По данным [2] максимальное количество всех пигментов образуется в период интенсивного роста водорослей. Во время логарифмической фазы роста культуры Dunaliella salina абсолютное содержание каротинов в клетках уменьшается [3, 4]. Накопление последнего наблюдается лишь при переходе культуры в стационарную фазу [2]. Поэтому мы эксперименты проводили в течение 24 ч в интенсивном режиме культивирования, где достигается только стационарная фаза роста. Адаптация растений к низким температурам связана с восстановлением нарушенного баланса между такими важнейшими физиологическими процессами, как рост, пигментообразование и фотосинтез [5].
Несмотря на то, что растения обычно обладают высоким уровнем антиокислительной активности и, как правило, содержат большое количество антиоксидантов различной химической природы [6–8], нам хотелось также исследовать, в какой степени ионол (классический синтетический антиоксидант) минеральной среды выращивания может влиять на биосинтез каротиноидов и хлорофиллов в клетках Dunaliella salinа.
Цель исследования: изучение в оптимальных и в условиях низкотемпературного стресса влияния различных концентраций 2,6 ди-трет-бутил крезола (ионола) в минеральной среде на рост и биосинтез пигментов в клетках Dunaliella.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования служила зеленая микроводоросль Dunaliella salina IPPAS D-294, выделенная из соленого озера Масазыр, находящегося на северо-западе территории города Баку.
Водоросли выращивали при температуре 27 °С в стеклянных фотореакторах (250 мл), на установке для выращивания культур одноклеточных водорослей. Минеральная среда содержала (г/л): NaCI – 175 (3,0 М); KNO3 – 5,0; KH2PO4 – 1,25; MgSO4 – 50; FeSO4 – 0,009 раствор микроэлементов (мг/л) – Ca(NO3)2•H2O – 735; H3BO3 – 735; ZnSO4•7H2O – 615; (NH4)MoO4 – 100; MnCl2•4H2O – 180. Суспензию клеток в фотореакторах в течение 24 ч освещали белым светом (16 Вт/м2) и непрерывно продували смесью (воздух + 1,5 % СО2) с температурой 27 °С для контрольных и 5 °С для опытных суспензий (низкотемпературный стресс). Клетки выращивали в течение 24 ч, в интенсивно-накопительном режиме культивирования и освещали круглосуточно. Рост культуры определяли периодическим подсчетом числа клеток в камере Горяева под микроскопом или нефелометрическим измерением оптической плотности суспензии на фотоэлектроколориметре.
В работе были использованы 2,6 ди-трет-бутил крезол (ионол) в концентрациях 25–500 мкМ. Ионол (M.в. 220,35 г/моль) в чистом виде порошок белого цвета, хорошо растворимый в этиловом спирте. В суспензию клеток добавляли синтетический антиоксидант с фиксированными концентрациями (25; 50; 150; 250; 350; 500 мкМ) и выращивали в течение 24 ч.
Содержание пигментов в клеточных экстрактах (100 % ацетон) измеряли на спектрофотометре и рассчитывали на основании коэффициентов Веттштейна [9].
Результаты исследования и их обсуждение
На рис. 1 (кривая 1) представлены результаты динамики роста культуры микроводоросли Dunaliella в оптимальных условиях (температура 27 °С, интенсивность света 16 Вт/м2, содержание СО2 в воздушной смеси 1,5 %, минеральная среда, содержащая 3,0 М NaCI). Выращивание клеток в 250 мл стеклянных фотореакторах и подаче воздушной смеси с температурой 25 °С в интенсивно-накопительном режиме культивирования в течение 24 ч показали, что оптическая плотность клеточной суспензии увеличивается в 3 раза.
Такая тенденция роста популяции продолжается и в последующих повторных вариантах выращивания контрольных суспензий. Подача в фотореакторы воздушной смеси с температурой 5 °С (низкотемпературный стресс) приводит к замедлению роста и снижению биопродуктивности на 25 % (кривая 2). Несмотря на снижение динамики роста популяции при низкотемпературном стрессе деление клеток в течение 24-часового культивирования в интенсивно-накопительном режиме составляет высокий показатель (увеличение оптической плотности в 2,5 раза). В этих условиях добавляли в минеральную среду выращивания синтетический антиоксидант 2,6 ди-трет-бутил фенол в различных концентрациях и прослеживали динамику роста культуры.
На рис. 2 представлена зависимость роста клеток Dunaliella salina IPPAS D-294 в интенсивно-накопительном режиме культивирования от различных концентраций ионола в минеральной среде. Как видно из рисунка, присутствие ионола в минеральной среде выращивания при высокой солености в оптимальном (1) и низкотемпературном (2) режимах культивирования заметно влияет на рост культуры. Так, при концентрациях 25 мкМ и 50 мкМ в минеральной среде ионола в оптимальном (1) режиме культивирования наблюдается стимуляция динамики роста культуры клеток на 4 % и 6 % соответственно, по отношению к контрольным суспензиям. При концентрациях (150; 250; 350 мкМ) в минеральной среде стимуляция роста остается на высоком уровне (107; 106; 102 %). Значит, 2,6 ди-трет-бутил крезол при концентрациях 25–350 мкМ сопоставим с активностью обычных фитогормонов [1].
Рис. 1. Динамика роста популяции клеток Dunaliella salina IPPAS D-294 при высокой солености в оптимальном (1) и низкотемпературном (2) режимах культивирования. Температура 27 °С, интенсивность света 16 Вт/м2
Рис. 2. Зависимость динамики роста популяции контрольных клеток Dunaliella salina IPPAS D-294 от различных концентраций ионола в минеральной среде (3,0 NaCI) при оптимальном (1) и низкотемпературном (2) режимах культивирования. Температура 27 °С, интенсивность света 16 Вт/м2
Рис. 3. Зависимость биосинтеза пигментов в клетках Dunaliella salina IPPAS D-294 от различных концентраций 2,6 ди-трет-бутил крезола в минеральной среде (3,0 NaCI), выращенных при оптимальном режиме культивирования. 1 – биосинтез хлорофилла а; 2 – биосинтез хлорофилла в; 3 – биосинтез суммы каротиноидов. Температура 27 °С, интенсивность света 16 Вт/м2
При повышении содержания 2,6 ди-трет-бутил крезола в минеральной среде (500 мкМ) оно приобретает обратный знак, наблюдается подавление до (8–9 %) соответственно роста культуры в течение 24-часового культивирования в интенсивно-накопительном режиме. Под влиянием этого синтетического антиоксиданта максимальная дифференцировка наблюдается при концентрации 150 мкМ (7 %) по сравнению с контрольными клетками. Сравнительное изучение зависимости роста популяции клеток Dunaliella salina IPPAS D-294 от различных концентраций 2,6 ди-трет-бутил крезола в минеральной среде с высокой соленостью, в условиях низкотемпературного стресса показала, что присутствие ионола в среде выращивания заметно влияет на рост культуры (рис. 2, кривая 2). Так, в диапазоне концентраций 25–350 мкМ в минеральной среде 2,6 ди-трет-бутил крезола наблюдается стимуляция роста культуры, которая превышает на 5–8 % контрольные суспензии клеток. Повышение концентрации синтетического антиоксиданта до 500 мкМ рост популяции клеток Dunaliella остается на контрольном уровне 100 %. В данном эксперименте видно, что присутствие различных концентраций 2,6 ди-трет-бутил крезола в минеральной среде с высокой соленостью в диапазоне 25–500 мкМ не сказывается (подавление роста не наблюдается) на биопродуктивности водорослей. В данном случае увеличивается толерантность клеток к антиоксиданту по сравнению с клетками, выращенными при оптимальном режиме культивирования, вероятно, связанного с работой эндогенной антиоксидантной системы клеток и 2,6 ди-трет-бутил креола.
Выраженная ростостимулирующая активность 2,6 ди-трет-бутил крезола при его концентрациях 25–350 мкМ в минеральной среде с высокой соленостью в оптимальном режиме культивирования и в диапазоне концентраций 25–500 мкМ при низкотемпературном стрессе делает этот антиоксидант перспективным и эффективным средством доступной и надежной регуляции (активации) роста культуры клеток Dunaliella salina IPPAS D-294.
На рис. 3 представлены результаты зависимости биосинтеза пигментов в клетках Dunaliella salina IPPAS D-294 от различных концентраций ионола в минеральной среде, выращенных при оптимальных условиях. Как видно из рисунка, ростостимулирующие концентрации 25–350 мкМ и последующая высокая концентрация 500 мкМ ионола снижают биосинтез общего количества хлорофиллов (до 82 % хлорофилла а; 85 % хлорофилла в), синтез суммы каротиноидов при этом несколько увеличивается до 6 %, по отношению к контрольным клеткам. Это характерно для водоросли Dunaliella где четко сказано, что при изменении условий существования абсолютное содержание и соотношение пигментов меняется [5]. Концентрации синтетического антиоксиданта в минеральной среде не влияют на соотношения хлорофилла а и хлорофилла в. При этом соотношения хлорофиллы/каротиноиды снижаются с увеличением концентрации ионола в минеральной среде.
На рис. 4 представлены результаты зависимости биосинтеза пигментов в клетках Dunaliella salina IPPAS D-294 от различных концентраций ионола в минеральной среде, выращенных в условиях низкотемпературного стресса. Как видно из рисунка, ростостимулирующие концентрации и последующие высокие концентрации ионола повышает биосинтез хлорофилла а (25мкМ), в интервале концентраций 50–500 мкМ биосинтез хлорофилла а снижается до 72 %. В этих условиях биосинтез хлорофилла в при концентрациях (25–350 мкМ) повышается до 15 %, а при 500 мкм резко снижается 65 %. Низкотемпературный стресс и увеличение концентрации синтетического антиоксиданта ионола в минеральной среде (3,0 NaCI) биосинтез суммы каротиноидов клетками повышается при концентрациях 25 и 50 мкМ на 46 % и 39 % соответственно, затем снижается и остается на контрольном уровне. В этих исследованиях увеличение концентрации синтетического антиоксиданта ионола в минеральной среде приводит к уменьшению соотношения хлорофилла а / хлорофилла в. Соотношения хлорофиллы/каротиноиды, при концентрациях 25–500 мкМ уменьшаются, по отношению к контрольным клеткам.
Рис. 4. Зависимость биосинтеза пигментов в клетках Dunaliella salina IPPAS D-294 от различных концентраций 2,6 ди-трет-бутил крезола в минеральной среде (3,0 NaCI), выращенных в условиях низкотемпературного стресса. 1 – биосинтез хлорофилла а; 2 – биосинтез хлорофилла в; 3 – биосинтез суммы каротиноидов. Температура 27 °С, интенсивность света 16 Вт/м2
Таким образом, увеличение концентрации синтетического антиоксиданта ионола в минеральной среде при оптимальных условиях выращивания клеток Dunaliella salina IPPAS D-294 соотношения хлорофилла а / хлорофилла в не меняется. Синтетический антиоксидант ионол в минеральной среде (3,0 NaCI) выращивания приводит к уменьшению соотношения хлорофиллы/каротиноиды в клетках. Низкотемпературный стресс увеличивает толерантность клеток к действию синтетического антиоксиданта ионола. В этом случае наблюдается уменьшение соотношения хлорофилла а / хлорофилла в, а также снижению соотношения хлорофиллы/каротиноиды, за счет подавления синтеза суммы хлорофиллов.