Нодулярный дерматит крупного рогатого скота (НД КРС) – высококонтагиозное, инфекционное, сопровождающееся сыпью, иногда смертельное заболевание КРС. Вирус НД относится к группе Neethling рода Capripoxvirus семейства Poxviridae. Вирус НД близкородственен к вирусам оспы овец и оспы коз. Морфологически вирионы вируса Neethling схожи с вирусом оспы овец, имеют округлую форму с двойной оболочкой и плотной сердцевиной. Вирионы размером 320–260 нм [1–4].
Нодулярный дерматит крупного рогатого скота имеет острую, подострую или скрытую форму. Тяжесть заболевания модифицируется соответственно от особенностей штамма каприпоксвируса, также от вида и рода восприимчивых животных [5].
НД КРС необходимо дифференцировать от папулезного стоматита КРС (Parapoxvirus), параоспы (Parapoxvirus), оспы и чумы КРС, кожной формы туберкулеза, гиподерматоза, онхоцеркоза, демодекоза, крапивницы, дерматофилеза, укусов клещей и насекомых [6].
Нодулярный дерматит является очень серьезной болезнью, требующей особого внимания и контроля со стороны ветеринарных служб. Несет реальную угрозу для отрасли животноводства: уменьшение поголовья, объемов продукции животноводства, эффективности воспроизведения, а также угроза качеству генетических ресурсов; запрет на производство, переработку и экспорт продукции животноводства [7, 8]. В связи с этим возникает задача о необходимости регулярного контроля за ростом эпизоотической ситуации в странах для своевременного предупреждения появляющихся вспышек заболеваний или минимизировании ущерба [9, 10].
Нодулярный дерматит согласно ранее существовавшей классификации инфекционных болезней входил в перечень особо опасных заболеваний крупного рогатого скота. На сегодняшнее время болезнь введена в список МЭБ, в связи с этим заболевание КРС данной болезнью подлежит непременной нотификации [11, 12].
Нодулярный дерматит впервые распространился на территории Южной и Восточной Африки в таких странах, как Зимбабве, ЮАР, Мозамбик, Гвинея, Ботсвана и Северной Африки – Оман, Бахрейн, Египет, Кувейт. Далее в 1960-е гг. вспышки нодулярного дерматита были зарегистрированы в Израиле, Палестине и Ливане. Немного спустя болезнь настигла такие страны, как Саудовская Аравия, Турция, Греция, Иордания и Сирия [13, 14].
В 2013–2014 гг. болезнь регистрировалась в Израиле, Ливане, Иордании, Палестине, Ираке и Египте. В этот же период Турция нотифицировала в МЭБ 325 вспышек болезни [7, 9]. Согласно данным государственных служб по ветеринарии в 2014 г. заболевание КРС нодулярным дерматитом было выявлено на территории Турции – более 200 очагов, 32 очагов в Ливане, по 16 в Азербайджане и Ираке, и по 6 очагов в Иране и Египте [11].
Впервые вспышки НД КРС были зарегистрированы в 2016 г. в Атырауской области Республики Казахстан [2].
Распространение вируса НД КРС в стране требует применения высокочувствительных диагностических экспресс-методов, которые позволят в довольно короткие сроки подтверждать диагноз с целью применения мер для предупреждения и борьбы с данным заболеванием.
Для диагностики разработаны такие методы, как классическая ПЦР [15, 16], а также и количественная ПЦР в режиме реального времени [17, 18], которые по сравнению с другими методами, такими, как электронная микроскопия, вирусовыделение и ИФА, имеют явное преимущество по доступности, чувствительности и специфичности [19].
Систематическая и своевременная диагностика послужит основой для эффективных оздоровительных мероприятий. Тем самым поможет быстрой локализации возникшего эпизоотического очага и предупреждению дальнейшему распространению болезни.
Для лабораторной диагностики отбирают биоптаты кожи, стабилизированную ЭДТА кровь, мазки со слизистых оболочек, сыворотку крови, которую транспортируют с соблюдением «холодной цепочки». Серологические методы исследования (реакция нейтрализации, иммунофлюоресцентный анализ антител, иммунопероксидазный монослойный анализ, ИФА) удлиняет срок диагностики НД, поэтому применяют молекулярно-генетические методы – ПЦР, ПЦР в режиме реального времени, видоспецифическую ПЦР (вирус нодулярного дерматита, вирус оспы овец, вирус оспы коз) [20, 21].
На современном этапе ПЦР-диагностика является самой общераспространенной и динамично прогрессирующей технологией. Интерес специалистов к методу ПЦР, на основе многократного реплицирования специфического участка нуклеотидной последовательности, катализируемое ДНК-полимеразой, возросло, когда практика показала, что разработанные иммуноферментные методы обнаружения специфических антител часто дают ложноположительные результаты. Также методы, основанные на выявлении вирусных белков с помощью специфических антител, не всегда срабатывают из-за высокой антигенной изменчивости вирусов и возможности перекрестных реакций с некоторыми клеточными белками. Кроме того, использование разных видов диагностики на основе иммунной химии – серологического анализа, твердофазного иммуноферментного анализа (ТФИФА), реакцией непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) и т.д. – не всегда приводит к удовлетворительным результатам. Таким образом, необходимость совершенствования диагностических методов принуждает обращаться к молекулярно-биологическим методам, в первую очередь ПЦР. Из года в год на рынке биопрепаратов появляется множество новых диагностических ПЦР тест-систем, которые предназначены как для обнаружения нуклеотидных последовательностей различных микроорганизмов – возбудителей заболеваний, так и для генетического исследования. Шаг за шагом снижается цена ПЦР-анализа, что способствует все более широкому использованию метода в диагностических учреждениях.
Применение метода ПЦР и различных его модификаций для диагностики инфекционных заболеваний обладает множествами преимуществами, такими как прямая детерминация ДНК возбудителя, высокоспецифичность, высокочувствительность, универсальность проведения процедуры, простота и удобство проведения анализа, скорость проведения анализа. Преимущества делают ПЦР незаменимой при диагностике персистирующих вирусных инфекций, для которых характерны низкие концентрации вируса в тканях и биологических жидкостях организма в латентный период заболевания [22].
Тяжелые случаи НД распознаются легко, так как они сопровождаются весьма характерными симптомами. Однако требуется лабораторное подтверждение с помощью ПЦР на начальных стадиях инфекции и при легких формах заболевания, таким образом можно быстро и уверенно определить заболевание.
По данным зарубежных авторов, поврежденные участки кожи, слизистых оболочек или подкожной клетчатки применяются для выделения вируса НД КРС. Вместе с пораженными тканями исследуются носовые истечения, истечения из пораженных глаз и слюна. При лабораторной диагностике НД КРС проводят выделение вируса в культуре клеток. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) применяется для выявления генома вируса в патологическом материале. С использованием данного метода выявляют не только геном возбудителя НД КРС, также дифференцируют его от близкородственных вирусов оспы овец и коз. Метод электронной микроскопии является экспрессным методом обнаружения вируса НД КРС и его распознанию от других патогенов [23].
Диагностика лабораторная. Идентификация агента:
- Образцы для выделения вируса и обнаружения антигена с использованием метода ИФА следует брать в течение первой недели появления симптомов, до того, как появятся нейтрализующие антитела. Образцы для ПЦР можно собирать по истечении этого времени.
- У живых животных образцы биопсии узлов кожи или лимфатических узлов могут использоваться для ПЦР, выделения вирусов и обнаружения антигенов.
- Вирус НД можно выделить из образцов крови (собранных в гепарин или ЭДТА) во время ранней, виремической стадии заболевания.
- Образцы пораженных органов, включая ткани, должны быть представлены для гистопатологии.
- Образцы тканей и крови для выделения вируса и обнаружения антигена должны быть охлаждены и отправлены в лабораторию на льду. Если образцы будут отправлены на большие расстояния без охлаждения, следует собрать крупные кусочки ткани, а среда должна содержать 10 % глицерина; центральная часть образца может использоваться для выделения вируса [24].
В связи с появлением заболевания в Республике Казахстан возникла острая необходимость иметь высокоэффективные диагностические биопрепараты, которые позволили бы идентифицировать возбудителя нодулярного дерматита КРС. Такого рода случай требует непрерывных поисков штаммов, пригодных для производства диагностических средств нодулярного дерматита КРС.
На сегодняшний день в казахстанском рынке биопрепаратов отсутствуют диагностические наборы и тест-системы для выявления НД КРС. В основном в рамках Государственного заказа закупаются импортными тест-системами для диагностики нодулярного дерматита.
Диагностические тест-системы зарубежных производителей выделяются своей дороговизной, что является проблематичным для животноводческих хозяйств страны. Тем самым стоит задача обеспечить животноводческий сектор Казахстана качественной и эффективной диагностической тест-системой в необходимом объеме и по доступным ценам.
В связи с обостренной ситуацией по нодулярному дерматиту в Казахстане, Республиканское государственное предприятие «Научно-исследовательский институт проблем биологической безопасности» Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан в рамках НТП: «Ветеринарная безопасность территории Республики Казахстан: эпизоотологический мониторинг, испытание, внедрение и коммерциализация средств специфической профилактики и диагностики особо опасных инфекционных заболеваний» (2018–2020 гг.) при финансировании Министерства сельского хозяйства Республики Казахстан разработала и внедрила в производство «Тест-систему для лабораторной диагностики нодулярного дерматита методом ПЦР», которая является конкурентоспособной зарубежным аналогам по параметрам чувствительности, специфичности, также доступности, что немаловажно для сельского хозяйства Казахстана.
В результате работ [25], проведенных авторами, была подобрана и синтезирована пара олигонуклеотидных праймеров: LSDV-2-f и LSDV-2-r. При постановке ПЦР олигонуклеотидные праймеры LSDV-2-f и LSDV-2-r с рабочей концентрацией 20 пмоль обладали более высокой специфичностью при выявлении вируса нодулярного дерматита КРС. Праймеры были использованы для амплификации фрагмента гена GPCR, кодирующего хемокиновый рецептор генома вируса нодулярного дерматита КРС. Ген GPCR считается одним из основных молекулярных биомаркеров для дифференциальной диагностики каприпоксвирусов: оспы овец, оспы коз и НД КРС. Конструированные праймеры были использованы при создании отечественной ПЦР тест-системы.
Тест-система для диагностики нодулярного дерматита крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакцией (ПЦР), применяется для выявления ДНК нодулярного дерматита крупного рогатого скота в пробах патологического материала (фрагменты тканей (пораженная кожа) и органов, цельная кровь, мазки со слизистых ротоглотки).
При диагностике заболевания с использованием тест-системы материалы с подозрением на нодулярный дерматит исследуются поэтапно методами молекулярной биологии – подготовка проб, выделение ДНК, постановка ПЦР, электрофоретический анализ продуктов амплификации ДНК в агарозном геле в строгом соответствии с инструкцией производителя.
В состав тест-системы для диагностики НД КРС методом ПЦР входят три набора, включая контрольные пробы. Тест-система рассчитана на проведение 55 анализов:
– набор № 1 для выделения ДНК;
– набор № 2 для проведения ПЦР-амплификации участка ДНК;
– набор № 3 для электрофоретичеcкой детекции продуктов амплификации в агарозном геле.
Результат диагностирования заболевания тест-системой методом ПЦР считается положительным, если в продукте реакции обнаруживается фрагмент ДНК вируса НД КРС размером 347 п.о.
В результате проведения производственного испытания тест-системы всего было исследовано 196 проб вирусного и патологического материала от больных и здоровых животных, доставленные из разных хозяйств. Из них 174 (88,78 %) проб показали положительный результат, соответствующий к ПЦР фрагменту в области 347 п.о. Тогда как образцы, выделенные от здоровых животных в количестве 22 (11,22 %), оказались отрицательными. Тем самым результат испытаний указывает на высокую эффективность тест-системы.
Согласно рекомендациям МЭБ для диагностики нодулярного дерматита применяются такие виды метода ПЦР, как классическая, так и в режиме реального времени. Стоит отметить, что предложенные и рекомендованные МЭБ методы выявляют также ДНК вирусов оспы овец и оспы коз [8]. По сведениям зарубежных авторов, существуют видоспецифичные методы ПЦР, которые могут дифференцировать вирусы НД, оспы овец и оспы коз [26].
Заключение
Таким образом, важно отметить, что на сегодняшний день самый востребованный и современный метод ПЦР считается надежным, чувствительным и специфичным для выявления вируса нодулярного дерматита в пробах от крупного рогатого скота. Специфичность метода ПЦР для лабораторной диагностики нодулярного дерматита КРС экспериментально проверена с ДНК представителями каприпоксвирусов (оспы овец и коз). Высокая специ- фичность данного метода обусловлена тем, что во всех случаях был получен отрицательный результат. Важно отметить, при постановке метода ПЦР были выявлены только ДНК полевых изолятов вируса нодулярного дерматита, тогда как результаты матрицы ДНК вирусов оспы овец, оспы коз и оспы верблюдов были отрицательными. В ходе экспериментов установлено, что метод ПЦР для лабораторной диагностики нодулярного дерматита КРС характеризовался высокой аналитической чувствительностью до 1 пг ДНК вируса нодулярного дерматита крупного рогатого скота [26].
Применение ПЦР-метода в лабораторной диагностике нодулярного дерматита способствует своевременному предупреждению распространению заболевания.
Метод полимеразной цепной реакции для диагностики нодулярного дерматита крупного рогатого скота рекомендуется для применения в профильных лабораториях и ветеринарных инстанциях, проводящих диагностические исследования болезней животных.
Работа выполнена в рамках ПЦФ: «Ветеринарная безопасность территории Республики Казахстан: эпизоотологический мониторинг, испытание, внедрение и коммерциализация средств специфической профилактики и диагностики особо опасных инфекционных заболеваний» (ИРН BR06249226) при финансировании Министерства сельского хозяйства Республики Казахстан.