Острый лейкоз – это острое злокачественное заболевание системы крови, с поражением на уровне детерминированных родоначальных стволовых клеток или ранних клеточных предшественников, характеризующийся наличием бластных клеток в костномозговом пунктате или в периферической крови от 20 % и более.
При постановке диагноза острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) цитогенетические, морфологические исследования по настоящее время остаются мощным инструментом в клинической практике, но для подробного изучения клеток костного мозга, метод проточная цитофлуометрия имеет свои, несомненно, большие преимущества.
На сегодняшний день, при постановке диагноза острого миелоидного лейкоза с помощью метода проточной цитофлуометрии, необходимо оценить иммунофенотипические особенности бластных клеток и определить вариант направленности миелоидной клеточной линейности и исключить Т и В-линейной или редкие варианты неясной линейности.
Клетки миелоидной линии развиваются в костном мозге из общего кроветворного предшественника. Ранними клетками моноцитарного ряда – это монобласты и промоноциты. В норме их содержание в костном мозге, крайне низкое.
По данным автора [1] монобласты экспрессируют маркеры предшественников СD34, CD117 и HLA-DR, в последовательности появляются СD4, CD64, СD36, CD33, СD11с, CD11b, СD15, CD14 и в стадии промоноцита интенсивность экспрессии данных маркеров увеличивается, а антигены ранней стадии дифференцировки (СD34, CD117) медленно исчезают. При диагностике острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), наиболее специфичным является обнаружение миелопероксидазы в цитоплазме опухолевых клеток.
Миелопероксидаза – линейно-специфический маркер миелоидной линии, лизосомальный фермент гранулоцитов. При иммунофенотипировании в случае не выявления миелопероксидазы, то для установления миелоидного варианта острого лейкоза, необходимо исследовать другие миелоидные антигены, включая маркеры редких форм ОМЛ (эритроидный, мегакариобластный), а также исключить лимфоидный вариант дифференцировки опухолевых клеток. С диагностической целью применяются определение линейной принадлежности опухолевых клеток наборы антител рекомендованные Международной группой экспертов Европейской сети лейкемии (ELN) [2], консорциума Еврофлоу[3], и для дифференциальной диагностики классификации European Group for the Immunological Characterization of Leukemia (EGIL) [4] и Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) [5].
Для подтверждения миелоидной направленности опухолевых(бластных) клеток необходимо оценить экспрессию миелоидных антигенов.
Как отмечают авторы [5], бластные клетки при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ) чаще всего экспрессируют маркеры предшественников (CD34, CD117, HLA-DR) и в редких случаях терминальную дезоксинуклеотидил трансферазу-TdT (Тerminal deoxynucleotidyl Тransferase), специализированная ДНК-полимераза, которая в норме добавляет N-нуклеотиды при реоранжировке генов Т и В клеточных рецепторов, увеличивая их вариабельность.
Встречается в 30 % случаев при остром миелоидном лейкозе СD7, экспрессия данного антигена может коррелировать с неблагоприятным прогнозом [6].
Как отмечают авторы [7], в будущем найдет свое мощное направление иммунотерапия, вакцинотерапия, гаплоидентичная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток при лечении острых лейкозов и других злокачественных онкогематологических заболеваниях.
На сегодняшний день, при правильном постановке диагноза «острый лейкоз», с определением направленности миелоидного варианта линейности и своевременном подборе ПХТ, необходимо провести аллогенную трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток. Своевременное проведение высокотехнологичного метода терапии гаплоидентичной (родитель, брат, сестра или плацентарная кровь) [7], или близкородственной, неродственной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, позволяет при наличии совместимого HLA–идентичного здорового донора [8].
Целью нашего исследования является выявление частоты распространенности и своевременный диагностический анализ иммунофенотипа опухолевой (бластной) клеточной линейности при остром миелоидном лейкозе у больных детей в Кыргызской Республике (Киргизии).
Материалы и методы исследования
В группу исследования с ноября 2016 г. по декабрь 2019 г. вошли 30 пациентов детей (женского пола – 16, мужского пола – 14) с острым миелоидном лейкозом, из них больные дети киргизской национальности – 24 (женского пола – 14 и мужского пола – 10) и жителей русскоязычного населения (смешанная нация и разной национальности) Кыргызской Республики (Киргизии) – 6 пациентов детей, из них детей (женского пола – 2, мужского пола – 4), все граждане Кыргызской Республики (Киргизии), в возрасте от 1,5 года до16 лет, проходившие обследование в отделении детской онкологии Национального центра онкологии и гематологии Министерства здравоохранения Кыргызской Республики и в отделении детской гематологии Ошской межобластной клинической детской больницы г. Ош, в г. Санкт-Петербурге больные консультированы врачами гематологами на базе Евразийского центра онкогематологии, иммунологии и терапии.
Метод с помощью проточной цитофлуориметрии использовался впервые, и проводилось иммунофенотипирование в г. Бишкек (Кыргызская Республика (Киргизия).
Метод с помощью проточной цитофлуориметрии
Материалом для исследования был костный мозг. Больным произведена пункция грудины. При получении материала, необходимо соблюдать технику сбора и для получения качественного результата, пункционный анализ не должен быть с примесью крови и механически в пробирке с ЭДТА не разрушать клетки во время пробоподготовки к иммунофенотипированию. Иммунофенотипирование лейкозных (бластных) клеток проводят на проточном цитофлуометре Cytomics FC500 (Beckman Coulter, США) с использованием моноклональных антител Beckman Coulter.
Статистическая обработка полученных результатов включала в себя анализ стандартных критериев. X2-квадрат, использовали для оценки достоверности различий по встречаемости определенных признаков между исследуемой группой. Определение величины «р», соответствующей найденному значению. X2-квадрат, велось на компьютерной программе с учетом одной степени свободы. Все математические расчеты и общий статистический анализ полученных исследований проводили с помощью персонального компьютера с использованием пакета прикладных программ для Электронных Таблиц Microsoft – ExcelM Версия 7,0 для Windows 95, для Windows-2010, Statistica-5.
Результаты исследования и их обсуждение
При проведении нами исследований, диагноз острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) устанавли вался на основании клинических данных и комплексных ряда общих и специальных лабораторно-диагностических показателей.
По результатам наших исследований в Кыргызской Республике (Киргизии) с острым миелоидным лейкозом(ОМЛ) у больных детей по возрастным показателям среди мужского пола выявляется в возрастах от 1,5 года до 1 года 11 месяцев, от 3лет – 3лет 11 месяцев, 8 лет – 8 лет 11 месяцев, 10 лет – 10 лет 11 месяцев и от 14 лет до 14 лет 11 месяцев и среди женского пола от 7 лет до 7 лет 11 месяцев, 9 лет – 9 лет 11 месяцев, 11 лет – 11 лет 11 месяцев и от 13 лет до 13 лет 11 месяцев, практически в 100 % случаев. Выявляются среди женского пола в возрастах от 2-х лет до 2 лет 11 месяцев в 77 % случаев, в 4 года до 4 года 11 месяцев в 50 % случаев, от 5 лет – 5 лет 11 месяцев в 32 % случаев, в 6 лет – 6 лет 11 месяцев в 50 % случаев и в 15 лет – 15 лет 11 месяцев в 50 % случаев, а среди мужского пола в возрастах от 2-х лет – 2 лет 11 месяцев в 23 % случаев, в 4 года – 4 года 11 месяцев в 50 % случаев, в 5 лет – 5 лет 11 месяцев в 68 % случаев, в 6 лет – 6 лет 11 месяцев в 50 % случаев, в 15 лет – 15 лет 11 месяцев в 50 % случаев.
При нашем наблюдении в возрастах от 12 лет до 12 лет 11 месяцев и от 16 лет до 16 лет 11 месяцев не выявлено ни среди женского пола, ни среди мужского пола – 0 % случаев, данные представлены на рис. 1.
Рис. 1. Сравнительная возрастная характеристика частоты выявляемости в Кыргызской Республике у больных детей женского и мужского пола острого миелоидного лейкоза
По значимости отличий, в Кыргызской Республике (Киргизии) острый миелоидный лейкоз у больных детей чаще выявляется среди мужского пола по сравнению с контрольной группой (женского пола) и имеет статистически достоверные различия, где р < 0,005.
По частоте распространенности среди больных детей киргизской национальности выявляется острый миелобластный лейкоз (вариант М1) в 32 % случаев, острый миелобластный лейкоз (вариант M2) в 69 % случаев, острый промиелобластный лейкоз (вариант М3) в 67 % случаев, острый миелобластный лейкоз (вариант М4) в 32 % случаев, острый монобластный лейкоз (вариант М5a, M5b) в 0 % случаев, данные представлены на рис. 2. В сравнении среди больных детей жителей русскоязычного населения Кыргызской Республики (Киргизии) выявляется острый миелобластный лейкоз (вариант М1) в 68 %случаев острый миелобластный лейкоз (вариант M2) в 31 % случаев, острый промиелобластный лейкоз (вариант М3) в 33 % случаев, острый миелобластный лейкоз (вариант М4) в 68 % случаев, острый монобластный лейкоз (вариант М5a, M5b) в 100 % случаев.
Рис. 2. Варианты острого миелоидного лейкоза(ОМЛ) среди больных детей киргизской национальности и жителей русскоязычного населения Кыргызской Республики(Киргизии)
По значимости отличий, в Кыргызской Республике(Киргизии) по вариантам течения заболевания острый миелобластный лейкоз (вариант М1) и острый миелобластный лейкоз (вариант М4) реже выявляется и практически не выявляется острый монобластный лейкоз (вариант М5a, M5b) среди больных детей киргизской национальности по сравнению с больными детьми жителей русскоязычного населения Киргизии, и имеют статистически высоко достоверные различия, где р < 0,0001.
Как видно, из представленного рис. 3, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) у больных детей среди женского пола киргизской национальности выявляется в 78 % случаев, а среди мужского пола в 83 % случаев.
Рис. 3. Распространенность среди женского и мужского пола у больных детей острого миелоидного лейкоза в Кыргызской Республике (Киргизии)
Рис. 4. Частота распространенности в Кыргызской Республике среди больных детей иммунологических вариантов острого миелоидного лейкоза (ОМЛ)
А среди больных детей женского пола жителей русскоязычного населения Кыргызской Республики (Киргизии) выявляется в 22 % случаев, среди мужского пола в 17 % случаев.
По значимости различий, по распространенности в Кыргызской Республике (Киргизии) острый миелоидный лейкоз чаще диагностируется среди больных детей (женского и мужского пола) киргизской национальности по сравнению с контрольной группой (женского и мужского пола больными детьми жителей русскоязычного населения Кыргызской Республики (Киргизии) и имеют статистически достоверные различия р < 0,005.
По данным наших исследований, как видно из представленного рис. 4, выявляются среди больных детей в Кыргызской Республики (Киргизии) наиболее распространенные – острый миелобластный лейкоз (М2) в 53 % случаев, острый миеломонобластный лейкоз (М4) в 20 % случаев и несколько реже выявляется острый промиелоцитарный лейкоз (М3) в 10 % случаев, острый миелобластный лейкоз (М1) в10 % случаев и острый монобластный лейкоз (5а, 5b) в 7 % случаев.
По значимости различий между вариантами ОМЛ и частоты выявляемости, наиболее распространенный и чаще диагностируется острый миелобластный лейкоз (вариант М2) и имеет статистически высоко достоверное различие, где р < 0,005.
Заключение
Таким образом, при остром миелоидном лейкозе важно выявление миелоидных маркеров, которые отражают ранние степени дифференцировки клеток для установления диагноза острого лейкоза. Иммунофенотипирование в диагностике вариантов миелоидной направленности опухолевых (бластных) клеток, для подтверждения миелоидной направленности необходимо оценить экспрессию миелоидных антигенов. Иммунофенотипирование с помощью проточной цитофлуориметрии при остром миелоидном лейкозе является одним из чувствительным методом в дифференциальной диагностике с учетом правильной, подробной характеристики десятки и сотни бластных клеток, и для постановки диагноза, позволяет выявить характерный иммунофенотип наличие миелопероксидазы (МРО), что диктует о необходимости своевременного подбора эффективной программы химиотерапии и после проведенной терапии при достижении полной ремиссии, выявления минимальной остаточной болезни.
Для определения варианта линейности и выявление частоты распространенности, и особенности течения острого миелоидного лейкоза у детей в Кыргызской Республике (Киргизии), необходимо проводить исследование методом с помощью проточной цитофлуориметрии. При остром миелоидном лейкозе, несмотря на изучение подробной характеристики бластных клеток, позволяющий выявить характерный иммунофенотип с помощью метода проточной цитофлуометрии, для подтверждения диагноза необходимо параллельно проводить цитогенетические, молекулярно-генетические и морфологические исследования.
По частоте распространенности острый миелоидный лейкоз встречается у больных детей и среди женского, и среди мужского пола, и течение заболевания более агрессивное, в связи, с чем необходимо при своевременной установке диагноза, определить направленность миелоидной линейности. Подбор и проведение полихимиотерапии, и пересадка гемопоэтических стволовых клеток, в частности у детей дает наилучшие результаты при наличии HLA-идентичного здорового донора.
Выводы
1. Исследовать костный мозг у больных детей с острым миелоидным лейкозом с помощью метода проточной цитофлуориметрии и параллельно проводить цитогенетические, цитохимические, морфологические исследования.
2. Скрининговое исследование опухолевых (бластных) клеток для определения линейной направленности.
3. Определить направленность – вариант миелоидной линейности и исключить лимфоидный вариант линейности.
4. Иммунофенотипирование методом проточной цитофлуориметрии позволяет выявить характерный миелоидной линейности иммунофенотип опухолевых (бластных) клеток и своевременно выбрать эффективную программу химиотерапии.