Менингиомы – самые часто встречающиеся опухоли центральной нервной системы (ЦНС) [1]. В классификации ВОЗ 2016 г. менингиомы могут соответствовать трем степеням злокачественности, наиболее часто выявляются менингиомы Grade I, обладающие в целом доброкачественным течением и включающие в себя три наиболее частых гистологических подтипа – менинготелиоматозные, фибробластические и смешанные [2]. Менингиомы Grade II преимущественно относятся к атипическим менингиомам, прогноз их, как правило, менее благоприятный – они чаще рецидивируют даже при радикальном хирургическом вмешательстве [2]. Менингиомы Grade III, большая часть которых принадлежит к классу анапластических менингиом, отличаются относительно неблагоприятным прогнозом [2].
Радикальное хирургическое вмешательство позволяет успешно справиться с большинством менингиом Grade I, тем не менее существуют и исключения. Даже при радикальном хирургическом удалении опухоли 20–25 % менингиом Grade I рецидивируют. Кроме того, часть менингиом может в дальнейшем подвергаться малигнизации с существенным ухудшением прогноза пациентов [3].
На сегодняшний день применяемые диагностические подходы, позволяющие провести надежную оценку свойств опухоли, в случае с менингиомами опираются почти исключительно на гистологические критерии [4]. При этом большая часть данных критериев плохо воспроизводима и дает лишь приблизительное представление о внутренних свойствах опухоли [5]. Вполне возможно, именно поэтому и средств таргетной терапии менингиом на сегодняшний день не существует.
В то же время одним из важнейших аспектов современных исследований опухолей является изучение свойств внутриопухолевой гетерогенности с выделением разнородных популяций клеток с различными молекулярными и функциональными свойствами. Важнейшей подобной популяцией, выделяемой во многих опухолях, являются опухолевые стволовые клетки (ОСК). Наличие камбиальных прогениторных клеток в составе ткани новообразования характерно для карциномы молочной железы [6], карциномы легкого [7], глиобластомы [8]. Более того, показано, что значимость данного вида клеток для злокачественного потенциала опухоли, а также их вклад в прогрессирование новообразования крайне велики. В частности, было выявлено, что ОСК могут не только играть ключевую роль в росте и распространении опухоли, но и обусловливать устойчивость опухоли к применяемым методам химиотерапии и лучевой терапии [9].
Тем не менее вопрос распространенности и роли клеток со стволовыми свойствами в развитии менингиом различной степени злокачественности остается практически неисследованным. В то же время данная проблема крайне важна, так как может помочь лучше понять внутреннюю клеточную иерархию менингиом и получить новые мощные диагностические и лечебные подходы. В рамках данной работы мы решили изучить экспрессию ключевого маркера стволовых свойств клеток CD 133 в менингиомах различной степени злокачественности.
Целью данного исследования явился сравнительный анализ экспрессии маркера ОСК CD 133 в менингиомах Grade I, Grade II и Grade III по классификации ВОЗ с применением иммуногистохимического метода для выявления данного маркера.
Материалы и методы исследования
Общая характеристика исследования
В данное ретроспективное исследование были включены по 30 пациентов с менингиомами Grade I (GI), менингиомами Grade II (GII) и менингиомами Grade III (GIII), прошедшие хирургическое лечение в ФГАУ «НМИЦ нейрохирургии имени академика Н.Н. Бурденко» в 2012–2015 гг. Гистопатологический диагноз был подтвержден тремя опытными патологами. При этом средний возраст составлял 62,29 ± 3,31 года, соотношение мужчин и женщин 42,22 %:57,78 %.
Иммуногистохимическое исследование
Проводилось приготовление срезов толщиной 3 мкм из парафиновых блоков с фиксированными в них образцами опухоли. Далее полученные срезы были депарафинированы ксилолом и повторно гидратированы с помощью различных концентраций этанола, после чего срезы высушивались при 45 °С. Далее проводилась последовательная инкубация срезов с кроличьими моноклональными антителами против человеческого антигена СD 133 (ZRB1013, Sigma-Aldrich, США).
Первичный анализ изображений
Затем все препараты были оцифрованы с использованием сканера Aperio 3T (Leica Biosystems, GmbH). Полученные сканированные изображения были проанализированы с помощью программного обеспечения Aperio ImageScope (Leica Biosystems, GmbH), ImageJ (Национальный институт здравоохранения, США) и QuPath (Университет Эдинбурга, Великобритания). Для оценки активности экспрессии СD 133 применялись два подхода. Первый подход включал в себя оценку количественного содержания клеток с позитивной экспрессией СD 133 в процентном отношении к общему количеству клеток в препарате (ПК СD 133). Кроме того, применялся подход с полуколичественной оценкой активности экспрессии CD 133 по типу методики histoscore (histoscore СD 133), для чего процент клеток со слабо положительным окрашиванием (низкая интенсивность экспрессии) умножался на единицу, процент клеток с умеренно положительным окрашиванием (средняя интенсивность экспрессии) умножался на два и, наконец, процент клеток с выраженно положительным окрашиванием (высокая интенсивность экспрессии) умножался на три, после чего результаты суммировались. Цветность меток характеризовалась с применением ранее предложенной нами методики [10].
Статистический анализ
Для проведения статистического анализа применялось программное обеспечение Matlab (The MathWorks, США). Для сравнения средних значений в группах менингиом использовался U-тест Манна–Уитни. Различия считались значимыми при p < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Количественное содержание клеток со стволовыми свойствами в менингиомах
При проведении количественной оценки содержания клеток со стволовыми свойствами в менингиомах различной степени злокачественности было выявлено, что в менингиомах GI среднее значение ПК СD 133 составило 14,26 ± 2,44 %, в менингиомах GII данный показатель составил 28,42 ± 2,34 %, в менингиомах GIII ПК СD 133 равнялся 46,48 ± 4,32 % (рис. 1). Также было выявлено, что средние значения ПК СD 133 в менингиомах GI статистически значимо различались как с аналогичным показателем в менингиомах GII (p = 0,001; Z = 5,14), так и в менингиомах GIII (p<0,001; Z = 5,38). Кроме того, было показано, что менингиомы GII также значимо отличаются от менингиом GIII (p = 0,004; Z = 5,12).
Таким образом, наименее выражена количественная составляющая активности экспрессии CD 133 в менингиомах GI, в то время как в менингиомах GII активность экспрессии значимо повышается и достигает максимальных показателей в менингиомах GIII.
Выявление полуколичественным методом активности экспрессии СD 133
При проведении оценки активности экспрессии СD 133 в менингиомах различной степени злокачественности было выявлено, что histoscore СD 133 в менингиомах GI составил в среднем 28,62 ± 2,44 %, в менингиомах GII данный параметр составил 48,46 ± 2,30 %, в менингиомах GIII он равнялся 68,58 ± 4,82 % (рис. 2). В то же время различия средних значений histoscore СD 133 в менингиомах GI в сравнении с менингиомами GII были значимыми (p = 0,014; Z = 4,84), также менингиомы GI значимо отличались по данному параметру от менингиом GIII (p < 0,001; Z = 5,18). Наблюдались значимые различия в данном показателе и между менингиомами GII и менингиомами GIII (p = 0,004; Z = 4,88).
В целом полуколичественный подсчет активности экспрессии СD 133 показал, что наименьшая активность экспрессии данного маркера выявляется в менингиомах GI, при этом она значимо выше в менингиомах GII, самое высокое значение выявляется в менингиомах GIII.
Полученные результаты четко формируют тенденцию в количественном содержании клеток со стволовыми свойствами в менингиомах. В целом наблюдается нарастание количества ОСК при увеличении степени злокачественности опухоли, что подтверждается с помощью двух разных методов оценки активности экспрессии стволового маркера CD 133 в иммуногистохимических препаратах менингиом. Данная закономерность крайне любопытна и хорошо согласуется с общими представлениями о молекулярных функциональных свойствах ОСК. Данный вид клеток вносит значительный вклад в процесс прогрессирования новообразований. Количественное содержание ОСК напрямую взаимосвязано не только со злокачественным потенциалом опухоли в целом, но также, в частности, с резистентностью клеток опухоли к химиотерапии и лучевой терапии.
Рис. 1. Выявление активности экспрессии СD 133 в менингиомах различной степени злокачественности, подсчитанной количественным методом
Рис. 2. Выявление активности экспрессии СD 133 в менингиомах различной степени злокачественности, подсчитанной полуколичественным методом
По-видимому, в данном случае более высокое содержание ОСК в атипических и тем более в анапластических менингиомах по крайней мере отчасти может обусловливать их более высокий потенциал прогрессирования и рецидивирования. Однако механизмы такого влияния могут быть разнообразными, поскольку для их аналогов при других опухолевых заболеваниях показано, что ОСК могут не только быть регенераторным пулом для различных клеточных популяций в опухоли, но также отличаются существенно более высокой клеточной пластичностью, что способствует появлению в них повышающих приспособительные возможности свойств. В частности, данная характеристика позволяет ОСК принимать самое активное участие как в формировании лечебной резистентности, так и в обеспечении кровоснабжения опухоли и повышении ее инвазивных свойств.
Поэтому полученные результаты крайне важны и открывают большие перспективы для дальнейших исследований. Для создания современных концепций патогенеза опухолей на фундаментальном уровне необходим дифференцированный подход с характеристикой свойств различных клеточных популяций. В то же время в клинической плоскости такой подход позволит создать принципиально новые средства прецизионной персонализированной диагностики и таргетного лечения пациентов с онкологическими заболеваниями с учетом всей полноты свойств внутриопухолевой гетерогенности.
Заключение
Таким образом, в представленной работе впервые было показано наличие в менингиомах экспрессии стволового маркера CD 133, причем количественное содержание клеток с наличием данного маркера значимо возрастает с повышением степени злокачественности опухоли. В целом наши данные позволяют заключить, что по своим молекулярным свойствам клетки менингиомы неоднородны и имеют различные молекулярные и функциональные свойства, при этом одной из важных клеточных популяций выступают клетки со стволовыми свойствами. Повышение количественного содержания данных клеток приводит к росту злокачественного потенциала менингиомы. Дальнейшие работы в данном направлении позволят значительно расширить диагностические и терапевтические возможности для данного вида опухолей в рамках концепции персонализированной медицины.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 19-29-01214 мк.