Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Наибольшая распространенность пищевой аллергии регистрируется у детей до 2 лет, составляя от 6 до 8 %, с возрастом распространенность пищевой аллергии уменьшается и у взрослых составляет около 2 % [1]. Зачастую весь спектр реакций на пищевые продукты неправомерно относят к пищевой аллергии, в то время как только треть всех проявлений непереносимости пищи реализуется через истинные IgE-зависимые аллергические реакции [2]. В структуре всей аллергопатологии за последние 5 лет, по данным института иммунологии МЗ РФ, истинная пищевая аллергия занимает 5,5 %; реакции на примеси в составе пищевых продуктов – 0,9 % [3]. Появились новые данные о связи кишечного биоценоза не только с патологией желудочно-кишечного тракта, но и с другими аллергическими заболеваниями [4; 5]. Исследования последних лет показали, что формирование и развитие нормальной иммунной системы ребенка во многом зависит от кишечной микробиоты, а именно от её формирования во внутриутробном периоде и в первый год жизни, а такие факторы, как рождение ребенка с помощью кесарева сечения, искусственное вскармливание и прием антибиотиков на первом году жизни, ведут к нарушению запрограммированной структуры микробиоты [6, 7]. Программирование кишечной микробиоты со стороны организма человека контролируется, в частности, экспрессией генов фукозилтрансфераз FUT2 и FUT3, отвечающих за синтез структур гликотопов антигенов групп крови: АВО (Н антиген) и Льюис-антиген [8]. Ген FUT2 может отличаться полиморфизмом, что ведет к изменению экспрессии фукозилированных олигосахаридов в грудном молоке у женщин и в муцинах слизистых оболочек [9]. Состав олигосахаридов грудного молока зависит от секреторного статуса кормящей женщины, а также от присутствия в генотипе матери H-антигена и антигенов системы Lewis. Влияние указанных генетических факторов определяет профиль олигосахаридов грудного молока, специфичный для носителей той или иной группы крови [9; 10]. Примерно до 20 % населения имеют инактивированный в результате мутаций ген FUT2, что приводит к «несекретантному» фенотипу, и, как следствие, структуры, несущие Н-антиген, не синтезируются на эпителиальных поверхностях слизистых и отсутствуют в молоке «матерей-несекретантов» [10]. Данные антигены являются специфическими олигосахаридами и связаны с муцинами, секретируемыми в желудочно-кишечном, мочеполовом и дыхательном трактах [11]. Они являются частью врожденного иммунитета, препятствуя адгезии патогенных микроорганизмов к эпителиальным клеткам кишечника [11]. Снижение количества и разнообразия диетических олиго- и полисахаридов ведет к сокращению как межвидового, так и внутривидового разнообразия кишечной микробиоты, а изменения в экспрессии Н-антигена могут провоцировать аллергические реакции [12]. Недавно было показано, что полиморфизм FUT2 гена является причиной генетической предрасположенности к повышенному риску аллергических заболеваний [12] и целиакии [14]. Современные методы диагностики ПА у детей раннего возраста в реальной клинической практике основываются на инвазивных технологиях, а диагностика нарушений микробиоценоза кишечника только на микробиологическом методе. Слюна же у детей является более доступной для исследования биологической жидкостью, которая содержит муцины, иммуноглобулины А, М, G, специфические белки АВО-системы, лизоцимы и другие биологически активные компоненты и таким образом является сложной и информативной биологической средой организма [15]. В связи с этим возможность исследования иммуноферментным методом (ИФА) наличия в слюне Н-антигена и летучих жирных кислот (ЛЖК) как у матери, так и у ребенка могут стать более доступным и простым методом диагностики ПА и дисбиоза кишечника.

Цель исследования – изучить уровень ЛЖК в слюне и кале у детей «несекретантного» фенотипа с верифицированным диагнозом ПА.

Материалы и методы исследования

Исследование проводилось в отделении иммунологии и аллергологии Больницы ПНЦ РАН, в рамках Госзадания по программе № 0576-2020-0003, после подписания родителями добровольного информированного согласия и одобрения локального этического комитета Б ПНЦ РАН. Обследовано 234 ребенка в возрасте от 0 до 3 лет с клиническими проявлениями пищевой непереносимости и имеющих отягощенный аллергологический и акушерский анамнезы. Верификация диагноза [16; 17] установила истинную пищевую аллергию у 104 детей, из которых у 19 детей был определен «несекретантный» фенотип, и они составили 1-ю группу наблюдения. Методом случай-контроль была сформирована 2-я группа наблюдения (n = 20), в которую вошли дети «секретантного» фенотипа, также в возрасте от 0 до 3 лет с верифицированным диагнозом ПА. Детей до года в 1-й группе наблюдения было 7, во 2-й группе – 9, и в группе контроля 8. В исследование не включались дети с текущим обострением кожных и респираторных проявлений, с лактазной недостаточностью, целиакией, воспалительными заболеваниями кишечника. В группу контроля были включены условно здоровые дети (n = 10) в возрасте от 0 до 3 лет без клинико-лабораторного подтверждения аллергических заболеваний.

Стандартные исследования биологического материала проводили в клинико-диагностической и бактериологической лабораториях Б ПНЦ РАН по методикам, утвержденным МЗ РФ. Специфический IgE (педиатрическая панель, атопическая панель, Российская панель) определяли хемилюминесцентным методом, с использованием наборов реагентов и тест-панелей на приборе OPTIGEN, Hitachy (Япония).

Определение Н-антигена в слюне проводили методом ИФА с использованием набора реагентов «Группоспот» ООО «Гематолог», Россия.

Исследование ЛЖК в слюне и кале осуществлялось в лаборатории «Гематеста» методом газожидкостного хроматографического анализа, который позволял оценить состояние микробиоценоза полости рта и кишечника [18; 19].

Статистическая обработка проводилась с использованием пакетов статистических программ Statistica 8. Отличия между группами считались достоверными при р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Все дети 1-й и 2-й групп наблюдения (м. – 21, д. – 18) находились в состоянии ремиссии, не получали в течение последних 3 месяцев пре- и пробиотиков и антибактериальных препаратов, имели факторы риска: отягощенная наследственность была у 34 детей (87,1 %), в 2 раза чаще по линии матери; токсикозы беременности регистрировались в 46,1 %, перенесенные инфекционные заболевания с применением антибиотиков во время беременности в 28,2 %. Родоразрешение у всех детей проходило естественным путем. Грудное вскармливание до 6 месяцев имели 32 ребенка, 7 детей с рождения были на искусственном вскармливании. У 29 детей (74,3 %) из 39 (1-й и 2-й групп наблюдения) кожные проявления возникли в течение первых 6 месяцев жизни, у 10 – к концу первого года. У 26 детей (66,6 %) имели место гастроинтестинальные проявления. Современные возможности лабораторной аллергодиагностики позволяют определять спектр причинно-значимых аллергенов.

Так, у детей раннего возраста [20] чаще всего выявляется аллергия к молоку, куриному яйцу, арахису, пшенице, сое. При определении специфического иммуноглобулина Е (sIgE) в наших исследованиях аллергия к белкам коровьего молока была установлена в 71,6 % случаев, к белкам куриного яйца – 59,1 %, рыбе – 23,5 %, пшенице – 22,9 %, а также наряду с пищевыми аллергенами появились sIgE к пыльце березы – 24,6 %, к клещам домашней пыли и шерсти кошки – по 22,7 %, к грибам рода Candida – 18,4 %. В анализе крови эозинофилы определялись у всех детей с верифицированным диагнозом ПА – 5,6 ± 2,1 % (p < 0,05), общий IgE – 241 ± 64 МЕ/мл (p < 0,05), что подтверждало аллергический IgE-зависимый генез клинических проявлений пищевой аллергии. Микробиологическое исследование состава микрофлоры полости рта показало, что у детей от года до 3 лет «несекретантного» фенотипа отмечен обильный рост анаэробов. Содержание стафилококков было выявлено у всех детей до года, у детей от 1 года до 3 лет – в 1-й группе у 6 (50 %), во 2-й группе – у 5 (33,3 %), в группе контроля у 3 (30 %), что указывало на более серьезные нарушения у детей «несекретантного» фенотипа. Следует отметить, что видовой состав микрофлоры полости рта у всех обследованных детей и их матерей «несекретантного» фенотипа был сравним между собой и представлен в основном стафилококками и стрептококками (S. aureus, S. epidermidis, S. pyogenes, S. dysgalactiae и др.), у 7 детей и их матерей (36,8 %) высевались лактобактерии и грибы рода Candida.

У детей «секретантного» фенотипа в возрасте от 0 до 3 лет также был отмечен обильный рост стафилококков, но отсутствовали грибы рода Candida. Видовой состав у матерей детей «секретантного» фенотипа был идентичен видовому составу их детей.

Дисбактериоз – наиболее часто встречающаяся патология, которая отражает изменения количественного и качественного состава бактериальной флоры ротовой полости [22].

О степени этих нарушений судят по составу ЛЖК, являющихся метаболитами анаэробных и аэробных популяций резидентной (постоянной) микрофлоры. В настоящее время к ЛЖК (фракции С2–С6) относят уксусную, пропионовую, изомасляную, масляную, изовалериановую, валериановую, изокапроновую и капроновую кислоты [22]. Микроорганизмы слизистой оболочки полости рта легко переходят в сообщающиеся полости и органы и взаимодействуют с их биотопами. Поэтому при снижении защитных свойств ротовой жидкости, в результате которого происходит замещение условно-патогенной микробиоты патогенной, происходит развитие дисбиоза слизистой оболочки полости рта различной степени тяжести, часто взаимосвязанного с аналогичными изменениями микробиоценоза в других областях слизистой оболочки [23]. Таким образом, при различных патологиях органов ЖКТ (желудка, кишечника, печени) изменяется микрофлора, а значит, и биохимические параметры слюны. По спектру летучих жирных кислот можно судить о локализации заболевания пищеварительного тракта.

В табл. 1 представлены результаты исследования ЛЖК у детей «несекретантного» фенотипа и их матерей.

В табл. 2 представлены результаты исследования ЛЖК у детей «секретантного» фенотипа и их матерей.

Таблица 1

Результаты исследования ЛЖК у детей «несекретантного» фенотипа и их матерей

(p < 0,05)

Таблица 2

Результаты исследования ЛЖК у детей «секретантного» фенотипа и их матерей

(p < 0,05)

Из представленных данных следует, что увеличение относительного содержания пропионовой и масляной кислот в качественном составе ЛЖК у детей «несекретантного» фенотипа и их матерей указывало на повышенное количество анаэробных микроорганизмов. Повышенный уровень пропионовой кислоты как у детей «несекретантного» фенотипа и их матерей, так и «секретантного» фенотипа, а также масляной кислоты соответственно, свидетельствовало об увеличении в полости рта смешанной анаэробной флоры и о наличии дисбиоза как у детей, так и у их матерей.

В группе детей «несекретантного» фенотипа эти изменения оказались в 2,2 раза выше по сравнению с изменениями у детей и матерей «секретантного» фенотипа, что указывало на более выраженный у них дисбиоз микрофлоры полости рта.

При изучении микробиоценоза кишечника у детей «несекретантного» фенотипа с верифицированным диагнозом ПА и их матерей микробиологическим методом у всех отмечено сравнимое нарушение микробиоценоза, которое выражалось в снижении содержания бифидобактерий до 107 и ниже КОЕ/г у 14 детей и 12 матерей (104–109), лактобактерий до 104 и ниже КОЕ/г у 12 и 11 соответственно (101–105), ассоциации условно-патогенных микроорганизмов в концентрации 106КОЕ/г и выше (104–109) обнаружены у 17 детей и 16 матерей, преимущественно за счет лактозонегативной или гемолизирующей Escherichia coli и Staphylococcus aureus.

В группе детей «секретантного» фенотипа и их матерей также отмечено снижение, но менее выраженное по сравнению с «несекретантным» фенотипом содержания бифидобактерий до 108 и ниже КОЕ/г у 14 и 12 (106–1010), лактобактерий до 105 и ниже КОЕ/г у 9 и 7 соответственно (104–107), а также повышение содержания гемолитических эшерихий в концентрации 104 КОЕ/г (104–105) у 11 и 9 матерей. Однако биохимическое исследование кала у детей «несекретантного» фенотипа и их матерей выявило более глубокие нарушения микробиоты кишечника. Так, у них отмечалось снижение уровня уксусной кислоты (С2), которая является основным метаболитом анаэробной, индигенной (постоянной) микрофлоры – бифидо- и лактобактерий, и аэробов – кишечной палочки с нормальными ферментативными свойствами, что способствует недостаточности местного звена иммунитета [25]. Показатели концентрации пропионовой кислоты (С3), которая продуцируется микроорганизмами Veilonella, Рropionobacterium, Bacteroides, Fusobacterium, у детей «несекретантного» фенотипа оказались существенно сниженными по сравнению с детьми «секретантного» фенотипа и по сравнению со здоровыми (p < 0,05), что говорит об угнетении ее основных продуцентов и дефиците соответствующих субстратов (сахаров, крахмала, пектинов) [26]. Такая же закономерность прослеживалась и по уровню масляной кислоты (С4), ответственной за состояние слизистой [26].

Таким образом, полученные данные свидетельствовали о снижении метаболической активности молочнокислой флоры: бифидобактерий и лактобактерий, а также о появлении штаммов с измененными ферментативными свойствами и о повышении метаболической активности условно-патогенной флоры. Все это указывает на ключевую роль микробиоты в становлении гомеостаза и иммунной системы у детей [26].

Заключение

Исследование показало, что слюна может стать информативной биологической жидкостью для изучения степени нарушения микробиоценоза не только полости рта, но и кишечника, отразив качественное и количественное изменение состава микрофлоры как у детей с «несекретантным» и «секретантным» фенотипами, так и у их матерей. Примечательно, что эти изменения были идентичными между детьми и их матерями. Полученные данные позволили рассматривать изменения метаболизма ЛЖК в качестве важного фактора патогенности и дадут возможность формировать группы риска по развитию пищевой аллергии до рождения ребенка. Более выраженные нарушения в микробиоте полости рта и кишечника у матерей детей «несекретантного» фенотипа могут создать предпосылки для изменения иммунного гомеостаза ребенка и негативно воздействовать на формирование микробиоты кишечника. На фоне снижения количества бифидобактерий ожидаемо повышение проницаемости эпителиального барьера кишечника для макромолекул пищи, усиление пищевой сенсибилизации, что создает условия формирования пищевой аллергии и других атопических заболеваний [27; 28].

Таким образом, дальнейшие исследования, направленные на возможности использования данных микробиоценоза слизи полости рта и кишечника с целью предупреждения и лечения аллергических заболеваний, в том числе и пищевой аллергии, можно считать весьма актуальными.

Авторы выносят благодарность Банниковой Н.П., Акимовой О.Н., Буробиной Т.В. за оказанную помощь в работе.