Острые кишечные инфекции (ОКИ) – одна из актуальных проблем здравоохранения всех стран [1], в том числе и Казахстана. Так, в Казахстане среди зарегистрированных инфекционных заболеваний в январе – декабре 2019 г. на втором месте после острых инфекций дыхательных путей стояли ОКИ – 22997 случаев [2]. Повсеместная распространенность, высокая частота развития среднетяжелых и тяжелых форм, осложнений, особенно у детей грудного возраста, определяют необходимость поиска путей оптимизации тактики лечения данной группы заболеваний.
Наиболее частой причиной кишечных инфекций являются такие возбудители, как колибактерии, сальмонеллы, а при определенных условиях и энтеробактер, цитробактер, клебсиелла, протеи, дрожжеподобные грибы, агенты вирусной природы. Часты случаи возникновения разнообразных воспалительных и септических процессов, обусловленных патогенными кокками, среди которых встречаются Staphilococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Pneumococcus (Diplococcus) pneumoniae и др. [3–6].
Сложность лечения инфекционных заболеваний связана с массовым нерациональным использованием антибиотиков и химиотерапевтических препаратов, приводящих к развитию множественной лекарственной устойчивости патогенов [7].
Кроме того, сами антибиотики часто оказывают побочное воздействие на организм человека. Наиболее частыми из них являются токсическое действие, аллергические реакции, дисбактериоз.
Дисбактериозы возникают при длительном лечении антибиотиками широкого спектра действия. При этом гибнут не только патогенные микробы, но и представители нормальной микрофлоры, которые в первую очередь стимулируют иммунную систему, нормализуют ее функционирование на разных уровнях: как местный иммунитет слизистых, так и системный: гуморальный и/или клеточный иммунитет. Нормальная микрофлора участвует также в переваривании пищи и производстве витаминов, ряда незаменимых аминокислот, защищает желудочно-кишечный тракт от возбудителей инфекций. При дисбактериозе некоторые группы возбудителей, невосприимчивые к используемому лекарству и не сдерживаемые больше полезными бактериями-симбионтами, начинают активно размножаться. В данном случае возникает эндогенная суперинфекция, такая как кандидоз. Таким образом, дисбактериоз не только осложняет уже имеющееся заболевание, но и делает организм более восприимчивым к другим заболеваниям [8].
В связи с этим в последнее время в мире для лечения кишечных и урогенитальных инфекций все чаще вместо антибиотиков рекомендуют использовать пробиотики на основе микроорганизмов – симбионтов желудочно-кишечного тракта. Пробиотики относятся к группе медицинских иммунобиологических лекарственных средств на основе живых бактерий, антагонистически активных в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов – возбудителей различных инфекционных заболеваний и не оказывающих отрицательного влияния на представителей нормальной микрофлоры человека.
Согласно определению ВОЗ, пробиотики – это живые микроорганизмы, которые при введении в адекватном количестве оказывают положительный эффект на здоровье организма-хозяина. В 2013 г. Международной научной ассоциацией пробиотиков и пребиотиков (International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics, ISAPP) в данное определение внесены уточнения, согласно которым название «пробиотик» может быть применено только к тем препаратам, которые отвечают следующим требованиям: есть точная информация о входящих в их состав микроорганизмах с указанием штаммов; сохраняется достаточное число жизнеспособных бактерий к концу срока годности; проведены исследования, подтвердившие безопасность и эффективность включенных штаммов [9].
Основными механизмами положительного действия пробиотиков являются: антагонизм к патогенным и условно-патогенным бактериям микробиоты, укрепление слизистого барьера желудочно-кишечного тракта, а также влияние на модуляцию иммунного ответа [10–12]. Кроме того, полезная микрофлора, заселяющая желудочно-кишечный тракт, участвует в метаболизме белков, углеводов, жиров и других веществ, поступающих в организм, либо образующихся в процессе пищеварения, осуществляет синтез биологически активных веществ: гидролитических ферментов, витаминов группы В и некоторых аминокислот, а также разрушает и выводит токсические вещества из организма человека [13].
Большинство данных относительно применения пробиотиков получены в исследованиях по изучению их эффективности в лечении и профилактике широкого спектра заболеваний желудочно-кишечного тракта, таких как инфекционные диареи, антибиотико-ассоциированные диареи, Clostridium difficile ассоциированные диареи, диареи путешественников, гастриты, связанные с инфекцией Helicobacter pylori, болезнь Крона, некротический энтероколит, а также в профилактике и/или лечении аллергических заболеваний, предотвращении и/или снижении инфекций урогенитального тракта [14, 15].
Вместе с тем известные лечебно-профилактические пробиотики против кишечных инфекций не всегда эффективны. Причиной этого является недостаточно широкий антимикробный спектр действия, не подбираются антагонисты к конкретным возбудителям заболеваний, а также штаммы – продуценты биологически активных веществ. В связи с изложенным в борьбе с ОКИ актуальными являются исследования по повышению эффективности пробиотических препаратов, расширению их спектра действия за счет правильно подобранного микробного состава.
Целью исследований была селекция активных штаммов пробиотических бактерий с широким спектром биологической активности и резистентностью к антибиотикам для создания эффективных пробиотиков направленного действия против кишечных инфекций человека.
Материалы и методы исследования
В работе использовали наиболее активные штаммы молочнокислых и пропионовокислых бактерий, выделенные от здоровых людей, из коллекции лаборатории микробных препаратов.
Для культивирования молочнокислых и пропионовокислых бактерий использовали питательную среду MRS с кобальтом. Культивирование бактерий в жидкой питательной среде проводили в течение 18 ч при температуре 32–37 °С.
Резистентность бактерий к антибиотикам устанавливали методом стандартных дисков, пропитанных антибиотиками, определение численности микроорганизмов – путем ряда последовательных разведений в стерильной водопроводной воде и высева их в агаризованную питательную среду с последующим подсчетом выросших колоний, антагонистическую активность – методом диффузии в агар в отношении различных тест-культур. Ферментативную активность определяли методом высева пробиотических культур на плотные питательные среды с добавлением в среду крахмала в случае определения амилолитической активности и казеина – протеолитической активности. Методом диффузии в агар определяли содержание витаминов группы В с использованием в качестве тест-культур следующих витаминзависимых микроорганизмов: В3 – Saccharomyces cerevisiae Meyen (Ленинградская расса), B5 – Zygofabospora marxiana Hansen, B6 – Debariomycesdisporus ВКМУ-1034, В8 – Saccharomyces carlsbergensis (Hansen). Количественное содержание витамина В12 устанавливали микробиологическим методом по зонам роста витаминзависимого штамма E. сoli 133-3 и рассчитывали по таблице Дмитриевой. Аминокислоты определяли методом жидкостной хроматографии.
Опыты проводили в трех повторностях. Для математической обработки результатов использовали стандартные методы нахождения средних значений и их средних ошибок. Статистическую достоверность полученных результатов определяли по t-критерию Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Первичный отбор произведен из 29 штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий, находящихся в коллекции лаборатории, по антагонизму к кишечной и сопутствующей инфекции.
Установлено, что ко всем испытанным тест-культурам антагонизм проявили штаммы L. рlantarum 14д/87 и 14д/19; L. fermentum 27; L. acidophilus 27w/77. Также выявлены штаммы с высокой антагонистической активностью к взятым тест-культурам за исключением 1–2 из них: L. рlantarum 14д/А-7, 14д/13, 14д, 2вА-6 и 2в/67; L. brevis Б-3/4, Б-3/А-26 и Б-3/43; L. cellobiosus 8д6 , 37н, 2/20 и 7н1; L. acidophilus 27w/60 и 98.
Наиболее активными антагонистами в отношении E. coli являются L. acidophilus 27w/60 и 98, L. рlantarum 14д/19 2вА-6 и 2в/67, L. cellobiosus 7н1 (зоны подавления роста 13,5–14,5 мм); S. gallinarum – L. acidophilus 98, L. рlantarum 14д/19, L. cellobiosus 2/20 и 2ж7 (зоны подавления роста 18,0–19,5 мм), Salmonеlla sp. – L. acidophilus 27w/77, 27w/60 и 98, L. cellobiosus 37н, L. brevis Б-3/36, L. fermentum 27 (14,5–16,0 мм); S. aureus 3316 – L. рlantarum 14д, 14д/13, 14д/19, 14д/А-7, L. acidophilus 27w/77, L. fermentum 27А-4 (11,0–12,5 мм); S. aureus № 9 – L. cellobiosus 2/20 и 2ж7, L. acidophilus 27w/77, 27w/60 и 98, L. brevis Б-3/А-26 и Б-3/43, L. fermentum 27А-4 (14,5–15,5 мм); C. albicans – L. brevis Б-3/4 и Б-3/6, L. fermentum 27, L. acidophilus 27w/77, L. рlantarum 14д/19 и 14д/13 (11,5–12,0 мм); K. pneumoniae – L. рlantarum 14д/87, 14д/19, 14д/А-7, 2вА-6 и 2в/67, L. acidophilus 27w/77, L. cellobiosus 2ж7 и 2/20 (14,5–15,0 мм); P. multocida – L. рlantarum 14д/19, 2вА-6 и 2в/67, L. cellobiosus 37н и 7н, L. fermentum 27 (14,0–15,0 мм); B. subtilis – L. рlantarum 14д/19, L. brevis Б-3/4 и Б-3/36, L. fermentum 27А-4 и 27, L. аcidophilus 98 (11,0–12,5 мм); Р. aeruginosa 1182 – L. рlantarum 14д/19 и 14д, L. brevis Б – 3/4, L. fermentum 27А-4, L. acidophilus 27w/77 (10,0–11,5 мм).
По результатам этого опыта отобраны для дальнейших исследований штаммы молочнокислых бактерий L. рlantarum 2в/А-6, 14д, 14д/19 и 14д/13, L. acidophilus 27w и 27w/77, L. brevis Б-3/А-26 и Б-3/43, L. fermentum 27 и 27А-4, L. cellobiosus 37н и 2/20 и пропионовокислые бактерии P. shermanii 8, которые были засеяны в питательную среду после третьего пассажа. После культивирования в течение 24 ч в них определяли антагонистическую активность.
Установлено, что все испытанные штаммы пробиотических бактерий проявили активность к тест-культурам Staphylococcus aureus, Salmonella gallinarum, Mycobacterium B5, Candida аlbicans, Pasteurella multocida, Bacillus subtilis, Escherichia coli 8739, Klebsiella pneumoniae АТСС 700603 и АТСС ВАА 2524, Staphylococcus aureus 3316 и 9, Salmonella enteritidis 35382 и Pseudomonas aeruginosa 835 и могут использоваться для составления пробиотиков направленного действия.
У штаммов L. fermentum 27А-4, L. acidophilus 27w, L. brevis Б-3/А-26, L. plantarum 14д и P. shermanii выявлена высокая амилолитическая активность (диаметр зон гидролиза крахмала 20, 30, 36, 30, 35 мм соответственно).
У штаммов L. рlantarum 2В/А-6, L. рlantarum 14д/13, L. brevis Б-3/А-26, L. acidophilus 27W установлена высокая протеолитическая активность (диаметр зон гидролиза казеина 14, 14, 16, 18 мм соответственно).
Важным свойством бактерий-антагонистов является их способность синтезировать витамины группы В (таблица).
В результате исследования витаминсинтетической способности у отобранных нами пробиотических микроорганизмов выявлено, что все они обладают ею в той или иной степени. Наиболее активными продуцентами пантотеновой кислоты (В3) являются P. shermanii (26 мм), L. рlantarum 14д/13 (23,0 мм), L. brevis Б-3/А-26 и L. fermentum 27 (22 мм), L. рlantarum 14д. и L. brevis Б-3/43 (21 мм), L. рlantarum 14д/19 (20 мм). Активными продуцентами никотиновой кислоты (В5) являются P. shermanii-8 (33 мм), L. brevis Б-3/А-26 и L. fermentum 27 (23 мм), L. brevis Б-3/43 (22 мм); пиридоксина (В6) – P. shermanii-8 (28 мм), L. acidophilus 27w/77 (17,5 мм), L. рlantarum 14д/19 и L. acidophilus 27w (16 мм); инозита (В8) – P. shermanii-8 (27 мм), L. рlantarum 14д, L. brevis Б-3/А-26 и L. fermentum 27 (23 мм); цианокобаламина (В12) – P. shermanii-8 (3,0 мкг/мл). L. acidophilus 27w и 27w/77 (0,60 и 0,62 мкг/мл).
Исследуемые штаммы бактерий отличаются по способности синтезировать аминокислоты.
Установлено, что треонин синтезируют все изученные культуры бактерий, однако более продуктивными являются L. plantarum 2в/А-6 (2,36 мг/100 мл) и P. shermanii-8 (2,10 мг/100 мл). Синтез валина установлен у монокультур L. plantarum 2в/А-6 и P. shermanii-8, обеспечивающих его содержание в культуральной жидкости 2,97 и 2,57 мг/100 мл соответственно. Увеличение количества метионина в среде отмечено только при выращивании L. brevis Б-3/А-26 (0,92 мг/100 мл) и L. brevis Б-3/43 (0,88 мг/100 мл). Синтез лейцина выявлен у всех отобранных бактерий, при этом более активными являются L. plantarum 2в/А-6 (4,25 мг/100мл) и P. shermanii-8 (3,05 мг/100 мл). Синтез лизина и гистидина установлен у L. plantarum 2в/А-6 (1,84 и 1,30 мг/100 мл соответственно).
В процессе исследования выявлена также способность отобранных штаммов пробиотических бактерий синтезировать такие заменимые аминокислоты, как аспарагиновая и глутаминовая кислоты, аргинин, пролин, глицин, аланин, тирозин.
Наибольшее количество аргинина обнаружено у P. shermanii-8 (8,2 мг/100 мл) и L. plantarum 14д (8,0 мг/100 мл). В исходной питательной среде данная аминокислота отсутствовала.
Синтез витаминов В3, В5, В6, В8 и В12 пробиотическими бактериями
|
Штаммы бактерий |
Диаметр зон роста витаминзависимых тест-культур, мм |
Содержание витамина В12, мкг/мл |
|||
|
В3 (пантотеновая кислота) |
В5 (никотиновая кислота) |
В6 (пиридоксин) |
В8 (инозит) |
||
|
L. рlantarum 2в/А-6 |
18,0 ± 0,4 |
16,0 ± 0,2 |
16,0 ± 0,3 |
15,0 ± 0,2 |
0.18 ± 0,3 |
|
L. рlantarum14д |
21,0 ± 0,5 |
10,5 ± 0,2 |
15,0 ± 0,2 |
23,0 ± 0,4 |
0,18 ± 0,02 |
|
L. рlantarum 14д/13 |
23,0 ± 0,4 |
12,0 ± 0,1 |
15,0 ± 0,3 |
21,0 ± 0,4 |
0,18 ± 0,02 |
|
L. рlantarum 14д/19 |
20,0 ± 0,5 |
12,0 ± 0,3 |
16,0 ± 0,3 |
22,0 ± 0,3 |
0,19 ± 0,03 |
|
L. acidophilus 27w |
16,5 ± 0,5 |
16,5 ± 0,2 |
16,0 ± 0,3 |
15,0 ± 0,2 |
0,60 ± 0,03 |
|
L. acidophilus 27w/77 |
18,0 ± 0,3 |
16,0 ± 0,3 |
17,5 ± 0,2 |
14,0 ± 0,3 |
0,65 ± 0,03 |
|
P. shermanii-8 |
26,0 ± 0,6 |
33,0 ± 0,6 |
28,0 ± 0,6 |
27,0 ± 0,2 |
3,00 ± 0,03 |
|
L. brevis Б-3/А-26 |
22,0 ± 0,4 |
23,0 ± 0,4 |
12,5 ± 0,1 |
23,0 ± 0,4 |
0,19 ± 0,01 |
|
L. brevis Б-3/43 |
21,0 ± 0,3 |
22,0 ± 0,2 |
14,0 ± 0,2 |
22,0 ± 0,3 |
0,18 ± 0,01 |
|
L. fermentum 27 |
22,0 ± 0,4 |
23,0 ± 0,2 |
15,0 ± 0,2 |
23,0 ± 0,3 |
0,17 ± 0,01 |
|
L. cellobiosus 2/20 |
15,0 ± 0,3 |
16,0 ± 0,2 |
15,0 ± 0,1 |
15,0 ± 0,3 |
0,17 ± 0,01 |
Наибольшее количество глутаминовой кислоты установлено у штаммов L. plantarum 2в/А-6, L. brevis Б-3/А-26 и P. shermanii-8 (от 8,0 и 8,5 мг/100 мл), серина – у L. plantarum 2в/А-6 (2,72 мг/100 мл) и P. shermanii-8 (2,0 мг/100 мл). Эти же штаммы являются лучшими продуцентами пролина, глицина, тирозина.
Изучена резистентность отобранных штаммов молочнокислых и пропионовокислых бактерий к используемым антибиотикам.
Установлено, что большинство исследованных штаммов бактерий чувствительны к ципрофлоксацину (30 мкг). Однако данный антибиотик не влияет на рост L. plantarum 2в/А-6, L. acidophilus 27w и 27w/77, L. fermentum 27. Хлорамфеникол (30 мкг) не подавляет рост L. plantarum 2в/А-6 и 14д/13, L. acidophilus 27w, P. shermanii-8, L. brevis Б-3/43 и L. fermentum 27, офлоксацин (5 мкг) – L. plantarum 2в/А-6, L. acidophilus 27w, P. shermanii-8, L. brevis Б-3/43 и L. fermentum 27.
Не оказывают влияние на рост всех испытанных пробиотических микроорганизмов антибиотики цефтриаксон (30 мкг), триметоприм (30 мкг), котримоксазол (25 мкг), канамицин (30 мкг). Угнетение роста у штаммов L. plantarum 2в/А-6 и 14д/13 происходит под влиянием диоксицилина гидрохлорид (30 мкг), у штаммов L. plantarum 2в/А-6 и 14д/13, L. acidophilus 27w/77 и L. cellobiosus 2/20 – антибиотика тетрациклина (30 мкг). Угнетение роста L. acidophilus 27w, P. shermanii-8 и подавление роста L. cellobiosus 2/20 и L. fermentum 27 происходит под влиянием гентамицина (30 мкг).
Заключение
Таким образом, проведена селекция активных штаммов пробиотических бактерий с широким спектром биологической активности и резистентностью к антибиотикам для создания эффективного лекарственного пробиотического средства направленного действия против кишечных инфекций человека.