Ожидается, что в ближайшие несколько лет в результате роста численности населения, развития стран с низким средним уровнем дохода и меняющихся предпочтений в пище потребление рыбы и морепродуктов увеличится почти на одну треть. В удовлетворении спроса на безопасные рыбные продукты глобальная аквакультура будет играть все более важную роль среди рыбного промысла. Аквакультура – это один из самых быстрорастущих продовольственных секторов в мире, ее производство стабильно растет на 7,5 % в год начиная с 1970 г.; ожидается, что к 2030 г. производство аквакультуры достигнет 109 млн т [1].
Однако, по прогнозам FАО, при достижении такого роста этот сектор столкнется с огромными экологическими проблемами, требующими новой стратегии устойчивого развития аквакультуры [2]. Глобальный тренд в аквакультуре – это возникновение новых возбудителей, вызывающих новые и неизвестные заболевания, которые будут быстро распространяться, в том числе по национальным границам, и вызывать крупные производственные убытки примерно каждые 3–5 лет. Быстрое расширение интенсивной аквакультуры во всем мире уже привело к увеличению распространенности трансграничных вирусных, бактериальных, паразитарных и грибковых инфекций у культивируемых водных организмов, что повлияло на устойчивость производства аквакультуры во многих странах [1].
В связи с этим возникла необходимость смены парадигмы в работе с рисками биобезопасности аквакультуры. Новая глобальная программа прогрессивного управления предусматривает инновационные технические разработки, касающиеся кормов, генетического отбора, биозащиты и контроля болезней, цифровых инноваций и т.д. Важно, что первым пунктом этой программы значится «усиление профилактики заболеваний в аквакультуре за счет ответственного рыбоводства (включая снижение устойчивости к противомикробным препаратам в аквакультуре и применение подходящих альтернатив противомикробным препаратам) и использования других научно обоснованных и проверенных технологиями мер» [1].
Цель исследования – научное обоснование применения пробиотиков на основе молочнокислых бактерий как наиболее успешных и безопасных противомикробных средств для аквакультуры.
Результаты исследования и их обсуждение
Успешный кандидат в пробиотики должен обладать несколькими важными критериями: не должен быть патогенным для рыб; не должен содержать генов устойчивости к антибиотикам, кодируемых плазмидой; должен обладать способностью переносить широкий диапазон pH (от слабокислого до сильнощелочного) и высокую концентрацию (2,5 %) солей желчных кислот; иметь высокую колонизационную способность; антагонистическую или ингибирующую активность против разнообразных возбудителей болезней рыб; производить внеклеточные ферменты (протеазу, амилазу, целлюлозу, фитазу, хитиназу, липазу, и др.); иметь местное происхождение [3]. Молочнокислые бактерии (МКБ), обладающие ценными свойствами, необходимыми для кандидата в пробиотики, могут быть весьма перспективными микроорганизмами для использования их в аквакультуре [4].
МКБ являются представителями нормофлоры как человека, так и рыб, обладают антагонистической активностью против условно-патогенных бактерий, вирусов и грибов, вызывающих заболевания рыб и моллюсков [5–7].
Молочнокислые бактерии являются безопасным микроорганизмами. Они имеют статус GRAS, объявленный FDA, а также статус QPS, присвоенный им EFSA, и могут служить биологическими пищевыми консервантами благодаря антимикробной активности их метаболитов, таких как органические кислоты (главным образом молочная кислота и уксусная кислота), диоксид углерода (СО2), перекись водорода (Н2О2), лизоцим, фенилмолочная кислота, жирные кислоты, антибиотики (Реутерин) и бактериоцины [8–10].
Основной продукт жизнедеятельности гомоферментативных МКБ – молочная кислота. Гетероферментативные молочнокислые бактерии в процессе ферментации гексоз образуют эксимолярные количества молочной кислоты, уксусной кислоты/этанола и диоксид углерода (CO2). Антимикробная активность молочной кислоты при низких концентрациях невысока, особенно при нейтральном pH. Уксусная кислота – более сильный ингибитор по сравнению с молочной кислотой в отношении бактерий, плесеней и дрожжей, тогда как пропионовая кислота обладает высокой антимикробной активностью. Из смеси кислот, производимых МКБ, молочная кислота, в основном, снижает кислотность, в то время как остальные кислоты (уксусная кислота и пропионовая кислота) работают как противомикробные средства путем воздействия на клеточную мембрану патогенов [11]. Недиссоциированные формы кислот диффундируют через стенку микробной клетки из-за их гидрофобного характера и затем диссоциируют внутри клетки. Это явление приводит к ингибированию метаболической активности патогенов и разрушению протонной движущей силы. Этот механизм, вероятно, также влияет на некоторые виды грибков.
Углекислый газ может выступать в качестве потенциального антимикробного средства в отношении других микроорганизмов в окружающей среде. Низшая концентрация CO2 способна стимулировать рост некоторых организмов, но наличие более высокой концентрации углекислого газа ингибирует его. Грамотрицательные бактерии более чувствительны к диоксиду углерода по сравнению с грамположительными бактериями [11].
Некоторые из МКБ (Lactobacillus johnsonii NCC 533, Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и др.) производят пероксид водорода H2O2 в присутствии кислорода под действием флавопротеинсодержащих оксидаз, супероксиддисмутазы и NADH-оксидазы [12]. Бактерицидное влияние H2O2 объясняется его сильным окислительным воздействием на бактериальную клетку. Некоторые H2O2 образующие реакции поглощают кислород, тем самым создается анаэробная окружающая среду, которая не подходит для определенных организмов.
Молочнокислые бактерии продуцируют вещества с антимикробной активностью, такие как реутерин, бактериоцины, антифунгальные пептиды и иные, активные в отношении как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий [9, 13]. Спектр ингибирования антимикробными соединениями МКБ включает такие микроорганизмы, вызывающие болезни рыб и моллюсков, как Aeromonas salmonicida, A. hydrophila, Edwardsiella tarda, Pasteurella piscicida, Vibrio anguillarm, V. salmonicida, V. harveyi, V. parahaemolyticus and Yersinia ruckeri, Lc. garvieae, S. iniae, патогенная E.coli, грибы рода Candida, плесневые грибы и др. [4–6].
Самыми изученными бактериоцинами молочнокислых бактерий в настоящее время являются Низин, Lactacin B, Lactocin 27, Plantaricin A, Plantacin B и Helveticin, Лейкоцин, Сакацин, Педиоцин PAl/AcH, Энтероцины AS-48, A, B и др. [9, 13, 14]. Они могут влиять на бактерии, ингибируя синтез клеточной стенки, увеличивая клеточную проницаемость мембран клеток-мишеней или ингибируя активности RNазы или DNазы. Бактериоцины молочнокислых бактерий нетоксичны для животных и человека, не меняют питательных свойств пищевых продуктов, эффективны при низкой концентрации, не теряют активности при охлаждении или нагревании и у патогенов не вырабатывается устойчивость к ним.
Антифунгальные пептиды молочнокислых бактерий демонстрируют потенциальные противогрибковые признаки в отношении микотокигенных грибов родов Aspergillus, Fusarium, Penicillium и Rhizopus, а также ингибирование синтеза микотоксинов и детоксикацию микотоксинов в растительном сырье, являющемся компонентом рыбных кормов, что немаловажно для рыбоводного сектора [15]. Gourama и Bullerman [16] сообщили о противогрибковых и антиафлатоксиновых свойствах молочной кислоты и других активных метаболитов МКБ. Известно о антифунгальной активности фенилмолочной кислоты и 4-гидроксилфенилмолочной кислоты, выделенных из Lactiplantibacillus plantarum [17]. Точно так же Dalie и иные [18] наблюдали ингибирование роста F. proliferatum и F. verticillioides молочнокислыми бактериями P. pentosaceus L006, выделенными из листа кукурузы. Считается, что штаммы МКБ обладают способностью детоксикации микотоксинов посредством механизма связывания с компонентами бактериальной клеточной стенки, такими как полисахариды и белки [19]. Некоторые ученые доказали детоксикацию молочнокислыми бактериями и бифидобактериями B1 афлатоксина, а также патулина и охратоксина А в водном растворе L. acidophilus ВМ 20 и B. animalis ВМ 12 [20]. Определены антифунгальная активность Pediococcus acidilactici и Pediococcus pentosaceus, а также их способность ингибировать образование зераленона [21].
Молочнокислые бактерии в многочисленных исследованиях in vitro и in vivo демонстрируют потенциальную противовирусную активность в отношении респираторных и желудочно-кишечных вирусов, таких как ротавирусы, норовирусы и энтеровирусы, сальмонидные вирусы [22]. Многие исследователи объясняют механизм противовирусной активности молочнокислых бактерий прямым контактом с вирусом, подавлением регуляции репликации вируса путем индукции экспрессии противовирусных генов или стимуляцией функций иммунной системы хозяина [23]. В исследованиях команды Y. Jung показано, что введение высоких доз Lacticaseibacillus casei способствует быстрой индукции антител IgG1 и IgG2a, врожденных иммунных клеток и цитокинов [24]. Лактобактерии поддерживают гуморальный и клеточный иммунитет, стимулируют выделение лизоцима, активируют фагоцитоз, что повышает общий уровень защиты организма от инфекций. Помимо этого, они обладают способностью сорбировать вещества, вызывающие аллергические реакции и гиперчувствительность к компонентам корма. Они участвуют в формировании феномена «оральной толерантности» к пищевым антигенам, т.е. помогают организму при пищевых аллергиях.
Производство и доступность внеклеточных ферментов, таких как протеазы, карбогидразы, амилазы, липазы и фитазы у молочнокислых бактерий, способствуют тому, что пробиотики на их основе положительно влияют на темпы роста хозяина, улучшая усвояемость корма.
Репродуктивное здоровье и качество гамет рыб является очень важным вопросом для рыбоводства, особенно для интенсивно размножающихся видов, поскольку большинство из них демонстрируют низкое качество гамет. Некоторые пробиотики на основе молочнокислых бактерий способствуют овуляции и плодовитости, а также положительно влияют на качество спермы и яйцеклеток, способствуют вылуплению и выживанию эмбрионов и личинок [25].
Молочнокислые бактерии, как мы уже указывали выше, считаются безопасными как для животных, так и для людей. Однако исследователи отмечают, что некоторые бактерии этой большой группы (Lactococcus lactis, Lc. garvieae, Enterococcus sp., Lacticaseibacillus casei и Lacticaseibacillus rhamnosus) могут быть причинами бактериальных инфекций [26]. Поэтому перед введением штаммов молочнокислых бактерий в кормовые пробиотики, добавкой к воде или пробиотики для борьбы с болезнями необходимо не пренебрегать тщательной оценкой их безопасности (патогенности, вирулентности, инвазивных свойств и т.д.). В целом же эта группа пробиотических микроорганизмов является наиболее безопасной и ценной для применения в аквакультуре, тем более что конечной инстанцией этой пищевой цепи является человек.
Заключение
Аквакультура – одно из самых динамично развивающихся направлений рыбного хозяйства, призванное восполнить потребности растущего населения в белке. Однако инфекционные болезни рыб и моллюсков являются серьезной проблемой, сдерживающей рост производства этого сектора рыбоводства. И важной проблемой в усилении профилактики и борьбы с заболеваниями водных животных представляется поиск новых экологичных, эффективных антимикробных средств, альтернативных антибиотикам и химическим препаратам, которые создают избирательные условия для появления устойчивых к лекарствам бактерий.
Пробиотики – это живые микроорганизмы, которые производят несколько полезных эффектов на водных животных – рыб, моллюсков и прочих (повышают иммунитет, помогают пищеварению, защищают от патогенов, улучшают качество воды, способствуют росту и размножению) и могут быть использованы в качестве альтернативы антибиотикам. Наиболее привлекательными потенциальными кандидатами в пробиотики для сектора индустриального рыбоводства являются молочнокислые бактерии из-за их высокой антагонистической активности, выработки и доступности внеклеточных ферментов. Используя пробиотики на основе молочнокислых бактерий в качестве добавок к воде, можно увеличить количество полезной микробиоты хозяина и активность иммунных ферментов в иммунных тканях слизистой оболочки рыбы, улучшить качество воды, воздействуя на микробные сообщества окружающей среды и уменьшая метаболические отходы в водной системе.
Пробиотики для аквакультуры на основе молочнокислых бактерий, прошедших тщательную оценку их пробиотических свойств и безопасности в условиях in vitro и in vivo, весьма эффективны и экологичны, могут обеспечить более быструю защиту рыб, чем пероральные вакцины, более безопасную защиту, чем антибиотики, при этом оказывая положительное влияние на здоровье рыб, их питание, иммунитет, воспроизводство и качество воды.
Данное исследование финансируется Комитетом науки Министерства образования и науки Республики Казахстан (Грант № AP09258412).