Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Герпесвирусные инфекции (ГВИ) – широко распространенные патогены в человеческой популяции. По оценкам ВОЗ, в мире вирусом ВПГ1 инфицированы около 3700 млн чел. в возрасте до 50 лет (67 % населения) и примерно 417 млн чел. (11 %) – ВПГ2. Распространенность ЦМВ-инфекции различается в разных регионах мира и варьирует от 45 % до 100 % [1, 2]. Среди населения России ежегодно регистрируются около 20 млн новых случаев герпесвирусной инфекции. Первичная инфекция и реактивация герпесвирусов человека вызывают серьезные заболевания, в том числе с летальным исходом. Особенно опасны ГВИ на фоне снижения иммунитета [3–5]. Все вышеизложенное позволяет считать ГВИ, в том числе ВПГ и ЦМВ этиологии, важной медико-социальной проблемой современного здравоохранения.

Основные методы медикаментозного лечения ГВИ направлены на подавление репродукции герпесвирусов в инфицированном организме. Известные специфические противовирусные препараты (ацикловир, ганцикловир и их аналоги), используемые для лечения ГВИ, имеют ряд недостатков. К наиболее существенным можно отнести токсичность и резистентность вирусов, которая развивается при длительном применении и при рекуррентных заболеваниях [6, 7]. В связи с этим актуальной задачей является поиск новых соединений, перспективных для разработки препаратов против герпесвирусных инфекций человека, различающихся механизмами действия и подавляющих ВПГ 1/2 и ЦМВ как дикого типа, так и мутантные лекарственно-устойчивые штаммы.

В последнее время интерес исследователей привлекают соединения теллура. В прошлом считавшиеся высокотоксичными соединениями, которые не представлены в живых организмах, в настоящее время соединения теллура привлекают пристальное внимание в связи с обнаружением белков, содержащих теллурметионин и теллурцистеин в клетках про- и эукариот, а также с широким использованием соединений теллура для получения наночастичных полупроводников, инсектицидов, магнитных дисков, ферментных электродов, используемых в диагностике различных заболеваний. Накопление теллурсодержащих соединений в окружающей среде и их высокая реакционность требует изучения токсических свойств данного класса соединений с параллельным изучением их биологической активности. В настоящее время синтезированы соединения теллура, обладающие различной биологической активностью [8, 9], однако противовирусные свойства химических производных теллура практически не изучены. На кафедре химии ФГБОУ ВО «Дагестанский государственный технический университет» синтезирован ряд новых теллурсодержащих соединений и показано, что при введении некоторых из них лабораторным животным наблюдается усиление интенсивности свободнорадикальных процессов в периферической крови и в печени. Представляло интерес выяснить, окажут ли влияние вновь синтезированные соединения на развитие герпесвирусных инфекций в клетках животных и человека.

Цель настоящей работы состояла в изучении цитотоксического эффекта четырех производных теллура в культуре первичных и перевиваемых клеток, а также противовирусных свойств в отношении инфекций, вызванных ВПГ1 и ЦМВ.

Материалы и методы исследования

Культура клеток. В работе использовали перевиваемую линию эпителиальных клеток почек зеленой мартышки – Vero и первичную культуру диплоидных фибробластов эмбрионов человека – ФЭЧ, полученные из коллекции клеточных культур при ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ России. Культуры были свободными от присутствия бактериальной или грибковой флоры. Клетки культивировали в среде Игла МЕМ (Vero) и Игла ДМЕМ (ФЭЧ) с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки.

Вирусы. Референс-штаммы ВПГ и ЦМВ были получены из коллекции вирусов при ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ России. Титр вируса, выраженный в количестве бляшкообразующих единиц в 1 мл – БОЕ/мл, определяли после заражения чувствительной культуры методом подсчета бляшек через 3–6 суток.

Вещества. Изучены противовирусные свойства следующих теллурсодержащих органических веществ:

1) [3-метилбензотеллуразол-2] [4-диметиламинобензо] триметинцианйодид (вещество 1),

2) [3-метилбензотеллуразол-2] [1-метилхинолин-2] триметинцианйодид (вещество 2),

3) [2-бензотеллуразолил–2] [4-метоксифенил] этен (вещество 3),

4) [2-бензотеллуразолил–2] [4-этоксифенил] этен (вещество 4).

Строение синтезированных соединений доказано данными элементного анализа и данными ЯМР-исследований. При исследовании биологической активности синтезированных теллурсодержащих гетероциклов ставилась задача возможного изучения влияния различных радикалов, содержащихся как в ароматическом кольце, так и в гетерокольце. При изучении противовирусных свойств исследуемых соединений в качестве положительного контроля использовали сертифицированные препараты, включенные в протоколы лечения инфекций, использованных в данной работе в качестве модельных ГВИ – ВПГ 1 – ацикловир, ЦМВ – ганцикловир. АЦВ, Зовиракс – «ГлаксоСмитКляйн Вэллком», Великобритания; ГЦВ, Цимевен – «Хоффман-ЛяРош», Швейцария.

Определение цитотоксичности. Цитотоксичность теллурсодержащих гетероциклов определяли по влиянию на жизнедеятельность клеток Vero и ФЭЧ, которую оценивали методом исключения витального красителя трипанового синего и методом МТТ. Острую цитотоксичность (ОЦД50), вызывающую гибель 50 % клеток, определяли через 24 ч после внесения различных концентраций гетероциклических соединений теллура. Хроническую токсичность (ЦД50) оценивали через 72 ч после внесения соединений. Значения 50 % цитотоксической дозы (концентрация, вызывающая гибель 50 % клеток в монослое) рассчитывали методом линейной регрессии с использованием пакета документов Microsoft Excel.

Противовирусную активность соединений определяли с использованием четырех схем воздействия: профилактическая, которая моделирует профилактическое воздействие – первая схема; микробицидная, моделирует экстренное профилактическое воздействие – вторая схема; лечебная, моделирует терапевтическое действие – третья схема; вирулицидная, характеризует способность соединений нейтрализовать вирус и/или инфекционную активность вируса – четвертая схема. Значения 50 % ингибирующей дозы гетероциклических соединений теллура, исследованных в данной работе, рассчитывали методом линейной регрессии. Учитывали степень подавления бляшкообразования на 50 % по отношению к контролю. Химиотерапевтический индекс (ХТИ) рассчитывали как отношение 50 % цитотоксической дозы к 50 % ингибирующей дозы.

Результаты исследования и их обсуждение

Цитотоксичность соединений. При опре- делении хронической цитотоксичности соединения использовались в различных концентрациях (от 0,1 мкг/мл до 500 мкг/мл). Значения ЦД50 для культуры клеток Vero значительно различались и составили от 0,7 мкг/мл до 160 мкг/мл. Цитотоксичность для клеток ФЭЧ (ЦД50), также варьировала, от 5,9 мкг/мл до 316,0 мкг/мл.

Поскольку вещества проявили выраженный антипролиферативный эффект, для сравнения приведены данные по цитотоксическому действию доксорубицина, антрациклинового антибиотика, широко используемого для лечения рака молочной железы и гематологических злокачественных новообразований. Данные представлены в таблице.

Статистический анализ показал, что значение ЦД50 для соединений 3 и 4 значительно больше по сравнению с таковым для соединений 1 и 2 в отношении культуры клеток Vero и ФЭЧ (Р < 0,001), что свидетельствует о более низкой цитотоксичности данных соединений.

Для определения острой цитотоксичности в отношении клеток ФЭЧ и Vero теллурсодержащие органические соединения использовали в более высоких концентрациях (от 1 мкг/мл до 1 мг/мл). Значения ОЦД50, которые были определены через 24 ч после внесения исследуемых веществ для клеток Vero варьировали от 0,9 мкг/мл до 180 мкг/мл, для диплоидных фибробластов человека от 7,3 мкг/мл до 577,2 мкг/мл. В данной схеме обработки также вещества 3 и 4 показали меньшую цитотоксичность в отношении обеих культур клеток (Р < 0,005).

Определение токсического действия соединений в отношении ФЭЧ и Vero показало, что наибольшим токсическим действием обладает соединение 2-[3-метилбензотеллуразол-2] (1-метилхинолин-2] триметилцианйодид. Для этого соединения были зафиксированы крайне низкие нетоксичные концентрации. Так, ОЦД50 и ЦД50 в первичной культуре составили 7,3 мкг/мл и 5,9 мкг/мл, а для перевиваемой культуры – 0,9 мкг/мл и 0,7 мкг/мл. Соединение 1-[3-метилбензотеллуразол-2] [4-диметиламинобензо] триметилцианйодид вызывало 50 % гибель клеток ФЭЧ на третьи сутки в концентрации 146,8 мкг/мл, для клеток Vero ЦД50 составил 3,5 мкг/мл. Если сравнить данные по ЦД50 для ФЭЧ, то этот показатель сходен с аналогичными данными для ганцикловира, эталонного препарата при лечении ЦМВИ. Надо отметить, что концентрации соединений 1 и 2, вызывающие гибель 50 % клеток первичной и перевиваемой культур при острой и хронической цитотоксичности практически не отличались.

Наименьшее цитотоксическое действие проявляли соединения 3 и 4-(2-бензотел- луразолил)-2-(4-метоксифенил) этен и (2-бензо- теллуразолил)-2-(4-этоксифенил) этен. Так, ОЦД50 для веществ 3 и 4 в культуре клеток Vero были равны 180 мкг/мл и 157 мкг/ мл, ЦД50 – 160 мкг/мл и 153 мкг/мл соответственно. Для фибробластов человека ОЦД50 превышали 400 мкг/мл и составили для 2-бензотеллуразолил-2-(4-метоксифенил) этена (вещество 3) – 577,2 мкг/мл и 433,6 мкг/ мл для 2-бензотеллуразолил-2-(4-этокси- фенил) этена (вещество 4). Токсическая доза через 72 ч обработки (ЦД50) составила более 300 мкг/мл для обоих соединений (таблица).

Цитотоксические эффекты 24- и 72-часового лечения теллурсодержащих веществ, изученные на двух линиях клеток in vitro (первичные ФЭЧ – диплоидные фибробласты человека и перевиваемые Vero – клетки почек зеленой мартышки), показали, что они сравниваются с таковыми для доксорубицина. Концентрации веществ ЦД50 и ОЦД50 для трансформированных клеток значительно ниже, чем для первичных клеток человека. Параллельно проведенное исследование токсичности данных соединений на крысах не выявило острой цитотоксичности в тех концентрациях, которые были введены животным. Дальнейшее исследование хронической цитотоксичности in vivo (эритроциты и клетки печени) показало, что она не обусловлена неспецифическим повреждением клеточных мембран, так как гемолитический потенциал в эритроцитах наблюдался при значительно более высокой концентрации.

Исследование противовирусных свойств соединений in vitro

Противовирусную активность синтезированных производных теллура в отношении ВПГ-инфекции изучали путем внесения различных концентраций веществ (от 0,1 мкг/мл до 10 мкг/мл) в четырех схемах воздействия, описанных в разделе «Материалы и методы исследования». Анализ значений ИД50 и ХТИ для каждого соединения показал, что два из них [2-бензотеллуразолил-2] [4-метоксифенил] этен (вещество 3) и [2-бензотеллуразолил-2] [4-этоксифенил] этен (вещество 4) проявили активность в вирулицидной схеме воздействия со значением ХТИ, равным 84 и 77. Для двух других соединений (вещества 1 и 2) значения ХТИ оказались низкими в связи с высокой цитотоксичностью, проявленной в отношении клеток Vero. Определение противовирусных свойств соединений in vitro в отношении ЦМВ-инфекции во всех изученных схемах не дало положительного эффекта.

В последние годы возрастает интерес к органическим соединениям теллура и их рассматривают как перспективное направление, так как показано присутствие теллура в биологических жидкостях [10] и были идентифицированы белки в организмах бактерий, дрожжей и грибов, имеющие в своем составе теллурометионин и теллуроцистеин [11]. В настоящее время имеются данные об их антиоксидантных, антипролиферативных, противовоспалительных и иммуномодулирующих свойствах [12].

Изучение цитотоксичности четырех производных теллура показало, что в больших концентрациях все соединения проявляют выраженную цитотоксичность, однако биологический эффект зависит от радикала, присоединенного к теллуру. Цитотоксическая доза изученных веществ была на два порядка ниже, чем для известного противоопухолевого препарата доксорубицин (от 0,7 до 160 мкг/мл против 0,02 мкг/мл), в первичных клетках ФЭЧ эта концентрация была еще ниже (5,9–316 мкг/мл). Существенным является то, что гемолитический потенциал эритроцитов наблюдался при очень высоких концентрациях (100–300 мг/мл), поэтому цитотоксичность изученных веществ нельзя отнести к неспецифическому повреждению клеточных мембран. Природа цитотоксического эффекта теллурорганических соединений требует дальнейшего детального изучения также в связи с исследованиями последних лет [11, 12], показывающими различные механизмы индукции клеточной гибели при различных концентрациях другого гетероциклического соединения – дифенил дителлурида.

Изучение противовирусной активности исследуемых веществ в стандартной лечебной схеме против ВПГ и ЦМВ не обладало терапевтической эффективностью, однако в отношении ВПГ-инфекции были получены интересные результаты относительно вируснейтрализующей активности соединений. Все изученные соединения обладали вируснейтрализующей активностью, но только включение в структуру метокси- и этоксигрупп позволило повысить порог токсичности для клеток и рассчитать химиотерапевтический индекс для веществ 3 и 4, который делает их перспективными соединениями для разработки комбинированных препаратов при лечении вирусных заболеваний, вызванных ВПГ.