Полиморфные сателлитные тандемные повторы генома человека входят в состав гетерохроматина прицентромерных и центромерных областей хромосом. Фракция сателлитных повторов, которая была обозначена как сателлит III (SatIII), локализована преимущественно в прицентромерном гетерохроматине нескольких хромосом. В ряде работ была описана транскрипция SatIII в клетках человека [1, 2]. Транскрипция сателлита является компонентом адаптивного ответа клетки на стресс. Однако транскрипция SatIII и последующая трансформация РНКSatIII в ДНКSatIII, благодаря активности обратной транскриптазы, может приводить к увеличению размера гетерохроматинового блока SatIII [3]. Клетки с очень большим размером блока прицентромерного гетерохроматина не имеют возможности для развития адаптивного ответа и не делятся. Количество таких клеток возрастает при старении и в условиях хронического окислительного стресса [4]. Можно предположить, что снижение уровня активных форм кислорода (АФК) приведет к снижению активности транскрипции SatIII в стареющих клетках. Показано, что фуллерены С60 и С70 связывают в больших количествах АФК. В работе мы исследовали влияние водорастворимой формы фуллерена С70 на транскрипцию субфракции сателлита III в составе прицентромерного гетерохроматина первой и девятой хромосом.
Материалы и методы исследования
Водорастворимое производное фуллерена С70 (F) (рисунок, А) было синтезировано и охарактеризовано в Институте проблем химической физики РАН [5]. Четыре клеточные линии фибробластов кожи взрослых людей были отобраны из коллекции МГНЦ. Клетки (15–20 пассаж) культивировали в стандартных условиях в присутствии 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (PAA Laboratories, Австрия) в СО2 инкубаторе при 37 °С. Фуллерен в нетоксичной концентрации 10 мкМ добавляли к клеткам на 24 ч.
МТТ–тест. Тест проводили по стандартной методике, используя реагент МТТ (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) фирмы Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) и прибор «EnSpire plate reader» (EnSpire Equipment, Turku, Finland).
РТ-ПЦР. РНК клеток выделяли с использованием набора «RNeasy Mini Kit» (Qiagen, ФРГ). РНК обработали ДНКзой 1 и провели обратную транскрипцию, применив «Reverse Transcriptase Kit» (Силекс, РФ). Амплификацию проводили с использованием набора «SYBRgreen PCR MasterMix» и прибора «StepOne Plus» (Applied Biosystems). Были использованы праймеры фирмы Силекс, РФ. В качестве стандарта применили ген TBP. Структура праймеров приводится в работе [4].
NQH (количественная нерадиоактивная гибридизация). Метод подробно описан в предыдущей работе и использовался без изменений [4]. В качестве ДНК-зонда на SatIII использовали плазмиду bio-pUC1.77, которую метили биотином методом ник-трансляции с помощью набора фирмы Силекс, РФ. ДНК из клеток для проведения гибридизации выделяли стандартным методом с использованием экстракции органическими растворителями [4]. Клетки лизировали в присутствии 1 % саркозилата натрия и 0,02 М ЭДТА, лизат обрабатывали последовательно РНКзой А и протеиназой К. После экстракции фенолом и фенол-хлороформом, ДНК водной фазы осаждали 70 % этанолом в присутствии 0,1 М ацетата натрия. Концентрацию ДНК определяли в комплексе с ДНК-связывающимся флуоресцентным красителем PicoGreen (Molecular Probes/Invitrogen, CA, USA).
Определение АФК
Использовали планшетный ридер (EnSpire Equipment, Finland),