Scientific journal
International Journal of Applied and fundamental research
ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,593

PHYTOCHEMICAL AND BIOLOGICAL STUDIES OF PLANTS OF KYRGYZSTAN INGENUS HEDYSARUM

Umralina A.R. 1 Konurbaeva R.U. 1
1 Institute of Biotechnology of the National Academy of Sciences of the Kyrgyz Republic
The article provides data on the study of plants of the genus Hedysarum growing on the territory of Kyrgyzstan – on the accumulation of flavonoids and antioxidant activity (AOA) in native plants and in vitro cultures – hairy roots. In the work, samples of 17 plant species collected in different territories of Kyrgyzstan were studied. Of the 17 species tested, the greatest effect was observed in H. neglectum, H. flavescens, and H. kirghisorum. The highest AOA values ​​were found in H. flavescens, both in flowers and leaves. High AOA in flowers was noted in H. dmitrievae. The advantage of using tissues in the production of formononetin is shown, which indicates the promising use of biotechnological methods that allow natural reserves of plants. The content of formononetin in the haity roots exceeded its content in native ones, and was more than 4 times in H. denticulatum, more than 7 times in H. parvum, more than 22 times in H. santalaschii, and in the native roots of H. daraut -kurganicum, traces of formononetin are found.
Hedysarum
flavonoids
AOA
hairy roots
formononetin

Всестороннее изучение дикорастущей флоры вызвано наличием ряда существенных проблем как в области сохранения биоразнообразия видов, так и в области фитохимических, фармакологических и биотехнологических исследований [1, 2]. Большое внимание уделяется изучению роли копеечников [3–5], в том числе и в традиционной медицине [6] Монголии, Китая, решаются проблемы таксономии [7] и биохимии рода [8–10]. За последние десятилетия при помощи различных методов хроматографии из растений рода Hedysarum стали известны 155 соединений, которые показали предполагаемую активность: антиоксидантную, активность против старения, регулирование активности иммунной системы, противоопухолевую активность [11].

Значительный интерес с этой точки зрения представляет род Hedysarum флоры Кыргызстана – один из многочисленных родов, включает 34 вида [12], что составляет 17 % мирового видового разнообразия, среди которых высок процент эндемиков. Особенности климатических и экологических условий в Республике, разнообразие географических зон способствуют биосинтезу и накоплению в растениях физиологически активных соединений. Их видовой состав, ареал, биоморфологические характеристики впервые были представлены в монографии Султановой [13].

При поддержке Королевского ботанического сада, Кью нами созданы при Институте биотехнологии НАН КР семенной банк [14, 15], коллекции культуры тканей и изолированных органов растений дикорастущей флоры, где хранятся коллекции рода Hedysarum (www.plant-biotech.kg).

Целью данного исследования было провести скрининг на содержание флавоноидов и АОА в нативных растениях и культурах in vitro – hairy roots.

Материалы и методы исследования

Было исследовано 17 видов растений рода Hedysarum из коллекции семенного банка, половина видов имеет статус эндемиков. Два вида – H. chaitocarpum и H. montanum – были продублированы в сравнительном изучении и взяты из двух разных географических зон. Местонахождение и природоохранный статус испытуемых растений приведены в табл. 1. Использовались гербарный материал, а также культуры тканей in vitro – hairy roots для определения количественного содержания флавоноидов для каждого вида и распределения их по частям растения, а также расчета АОА.

Таблица 1

Содержание флавоноидов и АОА растений рода Hedysarum

 

Вид

Природоохранный статус*

Местонахождение

Часть растения

Сумма флавоноидов, %

АОА, мг кверцетина/г сухого в-ва

1

Hedysarum

chaitocarpum

Regel et Schmalh

E,KRB,VU

Чаткальский хребет, Сары-Челекский заповедник, ущелье реки Ходжа-Ата

листья

1,60 ± 0,03

29,09 ± 0,8

стебли

0,36 ± 0,02

7,15 ± 0,2

корни

0,05 ± 0,0

9,34 ± 0,3

Ферганский хребет, ущелье р. Кугарт

листья

3,62 ± 0,04

31,08 ± 0,5

цветки

 

2,52 ± 0,07

стебли

0,21 ± 0,02

7,06 ± 0,03

корни

0,11 ± 0,01

9,29 ± 0,3

2

Hedysarum

cumuschtanicum B. Sultanova

E,VU

Талаский хребет, ущелье реки Кумуштаг

листья

2,52 ± 0,07

29,77 ± 0,4

цветки

1,12 ± 0,01

21,06 ± 0,5

3

Hedysarum

daraut-kurganicum B. Sultanova

E,VU

Хребет Кавак-Тоо, окрестности села Мин-Куш

листья

1,74 ± 0,05

26,32 ± 0,01

цветки

0,91 ± 0,02

14,39 ± 0,6

стебли

1,07 ± 0,06

18,41 ± 0,8

корни

0,09 ± 0,01

7,82 ± 0,3

4

Hedysarum

denticulatum Regel

SE

Алайский хребет, ущелье р. Оксу

листья

3,72 ± 0,04

38,76 ± 0,5

стебли

0,79 ± 0,01

13,49 ± 0,04

корни

0,53 ± 0,01

26,31 ± 1,5

5

Hedysarum

dmitrievae Bajt

SE

Пскемский хребет, ущелье реки Кара-Корум

листья

3,22 ± 0,08

38,03 ± 0,7

цветки

2,50 ± 0,03

33,79 ± 0,7

стебли

1,99 ± 0,02

19,25 ± 1,1

корни

0,24 ± 0,02

11,31 ± 0,1

6

Hedysarum

enaffae B. Sultanova

E,VU

Южный макросклон хребта Кунгей Ала-Тоо, бас. р. Тору – Айгыр

листья

1,63 ± 0.02

37,18 ± 1.9

цветки

0,96 ± 0,02

25,00 ± 1.3

Окончание табл. 1

 

Вид

Природоохранный статус*

Местонахождение

Часть растения

Сумма флавоноидов, %

АОА, мг кверцетина/г сухого в-ва

7

Hedysarum

ferganensis Korsh.

SE

Между хребтом Ак-Шийрак и Ферганским хребтом, перевал Ой-Кайын

листья

2,33 ± 0,06

29,08 ± 0,5

цветки

1,38 ± 0,02

21,72 ± 0,6

стебли

1,04 ± 0,02

13,52 ± 0,3

корни

0,11 ± 0,01

7,94 ± 0,1

8

Hedysarum

flavescensRegel. et Schmalh

SE

Ферганский хребет, перевал Урумбаш

листья

5,86 ± 0,03

40,45 ± 0,3

цветки

8,19 ± 0,09

48,32 ± 0,9

стебли

1,64 ± 0,04

17,47 ± 0,5

9

Hedysarum

gypsaceum Korotk

SE

Чаткальский хребет, перевал Джеде-Бель

листья

0,97 ± 0,03

34,50 ± 1,9

стебли

0,10 ± 0,01

7,84 ± 0,4

корни

0,11 ± 0,01

8,38 ± 0,03

10

Hedysarum

issykulensis E. Nikit.

х.ц.

Терскей Ала-Тоо, долина реки Конурулен, близ с. Конурулен

листья

1,68 ± 0,04

22,13 ± 1,0

стебли

1,33 ± 0,04

23,87 ± 1,3

корни

0,69 ± 0,1

9,68 ± 0,2

11

Hedysarum

neglectum Ledeb.

шр

Ферганский хребет, между с. Кош- Дюбе и перевалом Шордобель

листья

8,04 ± 0,02

46,33 ± 1,6

цветки

4,11 ± 0,08

31,51 ± 1,1

стебли

3,35 ± 0,1

20,69 ± 0,2

12

Hedysarum

kirghisorum B. Fedtsch.

SE

Долина реки Инылчек близ березовой рощи

листья

4,59 ± 0,07

40,67 ± 2,1

стебли

1,27 ± 0,1

19,57 ± 0,9

13

Hedysarum

montanum B. Fedtsch.

SE

Хреб. Тахталык, близ с. Тахталык

листья

1,85 ± 0,05

27,38 ± 1,9

цветки

1,42 ± 0,02

24,24 ± 0,9

стебли

0,56 ± 0,01

11,70 ± 0,5

корни

0,18 ± 0,04

9,36 ± 0,2

Чуйсккая область, северный макросклон, хребет Кыргызского Ала-Тоо

листья

2,28 ± 0,03

29,19 ± 0,8

стебли

0,63 ± 0,01

 

14

Hedysarum

songoricum B. Fedtsch.

SE

Хребет Кавак-Тоо, окрестности села Мин-Куш

листья

2,20 ± 0,01

34,08 ± 1,8

цветки

1,46 ± 0,02

25,95 ± 1.4

стебли

1,06 ± 0,02

13,67 ± 0,3

15

Hedysarum

parvum B. Sultanova

E,EN

Пскемский хребет, ущелье реки Кара-Корум

листья

1,81 ± 0,1

28,52 ± 1,4

цветки

0,85 ± 0,02

21,94 ± 0,4

стебли

0,23 ± 0,01

10,83 ± 0,4

корни

0,21 ± 0,02

16,78 ± 0,1

16

Hedysarum

santalaschi B. Fedtsch.

E,VU

Пскемский хребет, ущелье реки Кара-Корум

листья

2,18 ± 0,03

30,04 ± 0,6

цветки

1,79 ± 0,01

31,47 ± 0,9

стебли

0,39 ± 0,02

9,29 ± 0,3

корни

7,06 ± 0,03

17

Hedysarum

turkestanicum Regel et Schmalh

E,VU

Южные отроги Чаткальского хребта близ пос. Шекафтар

листья

1,40 ± 0,01

28,54 ± 0,3

Примечание. *E – эндемичный вид; SE – субэндемичный вид; VU – вид находится под риском стать вымирающим; EN – вымирающий вид; х.ц. – хозяйственно-ценный вид; шр – широко распространенный вид; KRB – вид, находящийся в Красной книге.

В образцах определяли сумму флавоноидов и антиоксидантную активность (АОА). Для расчета суммарного содержания флавоноидов использовали экспресс-методику [16, 17]. АОА определяли двумя методами – в соответствии с описанием патентного изобретения Т.В. Максимовой и иных [18] и с использованием DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом).

На хроматографе Agilent 1260 Infinity методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) определяли содержание изофлавона (формононетина) в экстрактах растений. Для анализа использовались нативные корни и hairy roots 4 видов растений рода Hedysarum из коллекции трансформированных корней копеечников, которые ранее были получены лабораторией Института биотехнологии растений НАН КР. Калибровку хроматографа проводили по стандарту формононетину с использованием колонки Eclipse Plus C18, 5 µm, 4,5 х 250 мм.

Результаты исследования и их обсуждение

Большее накопление флавоноидов отмечали в листьях по сравнению с другими частями растений, исключением был вид H. flavescens, у которого в цветках содержание флавоноидов превышало их содержание в листьях, данные представлены в табл. 1. Из 17 испытуемых видов наибольший эффект отмечен у H. neglectum, H. flavescens и H. kirghisorum. При сопоставлении одних и тех же видов, произрастающих в разных географических зонах (H. chaitocarpum и H. montanum), было отмечено, что количество флавоноидов существенно различалось. Это соответствует данным о том, что различия в химическом составе могут иметь место в пределах одного и того же вида в зависимости от географического происхождения [19].

Результаты определения АОА двумя методами представлены в табл. 1 и на рис. 1. Следует отметить, что наблюдалась определенная корреляция между данными, полученными в обоих экспериментах. Наивысшие показатели АОА были выявлены у H. flavescens, как в цветках, так и в листьях. Высокая АОА в цветках была отмечена у H. dmitrievae.

missing image file

Рис. 1. Сравнительный анализ АОА в разных частях растений видов копеечника с использованием DPPH

Определенный интерес представляют изучение компонентов флавоноидной природы не только в нативных растениях, но и в тканях растений Hedysarum и проведение сравнительного анализа гербарного материала и культур тканей. В работе были использованы культуры hairy roots из коллекции банка семян Института биотехнологии [20].

Ранее нами совместно с И.Н. Кузовкиной (ИФР РАН) был проведен анализ корней эндемика H. enaffae (hairy root and isolated root) на базе Института фармакогнозии Университета им. Семмельвайса (Будапешт, Венгрия) [21]. Результаты ВЭЖХ анализа корней H. enaffae показали, что доминирующим компонентом культивируемых in vitro корней hairy roots являются изофлавоны – производные формононетина. Обнаруженные четко выраженные пики веществ соответствуют двум изофлавонам, которые были идентифицированы на основании данных ВЭЖХ и UV-спектроскопии и подтверждены данными 1H- и 13С ЯМР-спектрометрии, проведенной в Институте химической экологии им. Макса Планка в Йене (Германия). Результаты хроматографии показали, что доминирующим флавоноидом hairy roots and isolated roots копеечника является изофлавон ононин.

Изофлавон ононин является гликозидом агликона формононетина, который в свободном виде не обнаружен в корневых культурах H. enaffae (в отличие от hairy roots of H. theinum). Поскольку основным компонентом культивируемых корней H. enaffae является ононин, было определено количественное содержание этого изофлавона в hairy roots. На основании данных ВЭЖХ по площади пиков была вычислена концентрация ононина в этих двух культурах. Результаты показали, что концентрация ононина в hairy roots составляет 10,91 мг/г сухого веса корней (или 1,1 %), в то время как в изолированных корнях концентрация изофлавона – 0,945 мг/г сухого веса (или 0,095 %), т.е. на один порядок ниже.

Результаты приведены в табл. 2.

Таблица 2

Содержание формононетина в нативных (NR) и трансформированных корнях (HR) растений рода Hedysarum, мг/г сухого вещества

Вид

Нативные корни

Hairy roots

H. daraut-kurganicum

0

0,663

H. denticulatum

0,271

1,212

H. parvum

0,070

0,539

H. santalaschii

0,056

1,247

Содержание формононетина в hairy roots превышало его содержание в нативных растениях более чем в 4 раза у H. denticulatum, более чем в 7 раз у H. parvum, более чем в 22 раза у H. santalaschii, а в нативных корнях H. daraut-kurganicum обнаруживаются следы формононетина.

missing image file

Рис. 2. Хроматограмма нативных (А) и hairy roots H. denticulatum (Б) по определению формононетина

Выводы

Исследованы 17 видов рода Hedysarum флоры Кыргызстана, большинство из которых имеют природоохранный статус «эндемики» и «субэндемики». В нативных растениях выявлено высокое содержание флавоноидов и АОА у H. neglectum, H. kirghisorum и H. flavescens. Сравнительное изучение содержания формононетина в нативных растениях и в hairy roots показало превышение его концентрации в несколько раз в hairy roots по сравнению с нативными растениями, что говорит о преимуществе использования методов биотехнологии.