Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Мужское бесплодие является социально значимой проблемой с частотой встречаемости в мире более 10 %. Известно, что в половине случаев мужское бесплодие является идиопатическим [1]; в некоторых исследованиях у пациентов в семенной жидкости обнаруживали маркеры окислительного стресса, что может свидетельствовать о значимой роли окислительного стресса в патогенезе мужского бесплодия [2].

Цепи микросомального окисления цитохрома b5 и P450 являются ключевым звеном метаболизма лекарственных препаратов и эндогенных соединений, который протекает с участием активных форм кислорода (АФК). Таким образом, нарушения в работе этих систем тесно связаны с развитием окислительного или антиоксидантного стресса. NADH-зависимая цитохром b5-редуктаза (CYB5R) принимает участие в синтезе холестерина, элонгации жирных кислот, гидроксилировании ксенобиотиков и стероидных гормонов, поддерживает в восстановленном состоянии аскорбат и коэнзим Q10 и защищает клетку от апоптоза [3]. CYB5R является цитозольным ферментом, который в присутствии NADH восстанавливает люцигенин, что сопровождается хемилюминесценцией. NADPH-зависимая цитохром P450-редуктаза (CYPOR) восстанавливает цитохром Р450, цитохром b5, гемоксигеназу, сквален-монооксигеназу, 7-дегидрохолестерол редуктазу, при этом побочными продуктами являются супероксидный анион-радикал и пероксид водорода [4]. Исследований, посвященных изучению роли систем микросомального окисления в патогенезе бесплодия, немного, однако показано, что с идиопатическим бесплодием может быть связан полиморфизм гена CYP1A12A [5].

Одним из направлений лечения мужского бесплодия является применение кломифена цитрата, селективного модулятора эстрогенных рецепторов, приводящего к повышению уровня тестостерона за счет повышения уровня ЛГ и ФСГ [6]. Кломифена цитрат метаболизируется через систему цитохрома Р450, таким образом измененная активность этой системы может влиять на эффективность терапии кломифена цитратом, с одной стороны, с другой – может представлять дополнительную терапевтическую мишень.

Цель исследования – изучить активность CYB5R и CYPOR в сперматозоидах при экспериментальном крипторхизме у крыс, в том числе после лечения кломифена цитратом, при помощи оригинальной методики люцигенин-активированной хемилюминесценции со стимулами NADH и NADPH соответственно.

Материалы и методы исследования

Животные. Для моделирования двухстороннего абдоминального крипторхизма были отобраны 25 крыс породы Wistar самцов в возрасте 3,5–4 месяца, стандартного веса. Эксперименты выполняли в соответствии с требованием Хельсинкского соглашения о гуманном обращении с животными.

Яички крыс через паховый канал выводили из мошонки в брюшную полость с помощью нити Prolene 4/0, атравматично фиксировали в области латеральных каналов к брюшной стенке. Через две недели удаляли лигатуру и яички низводили обратно.

Для дальнейшего эксперимента животные были разделены на группы. Контрольная группа включала 7 животных, в группе нелеченых животных (9 крыс) после низведения яичек лечебных мероприятий не проводили. Группе животных с терапией кломифена цитратом (Sigma, Германия) (9 крыс) после низведения яичек ежедневно в течение 2 месяцев с помощью инсулинового шприца интраперитонеально вводили 1,25 мг препарата в 1 мл физраствора.

Для оценки активности тканевых микросомальных редуктаз спустя 3 месяца после низведения в мошонку яички с придатками удаляли, придатки взвешивали и гомогенизировали в растворе 5 %-ной глюкозы в соотношении ткань/раствор 1:10. При помощи дозатора отбирали 50 мкл взвеси и анализировали, как описано ниже.

Хемилюминесцетный протокол. Оценку активности микросомальных редуктаз сперматозоидов методом стимулированной хемилюминесценции проводили для обоих придатков в идентичных условиях – в параллельных кюветах на 12-канальном приборе Lum-1200 («ДИСофт, Россия). В кювету хемилюминометра, содержащую раствор Хенкса (рН 4,1), стабилизированный HEPES (Sigma-Aldrich, США) и 200 мкМ люцигенина (динитрат 10,10’-диметил-9,9’-биакридиния) (Sigma, США), помещали 50 мг ткани и регистрировали спонтанную хемилюминесценцию в течение 10 минут, затем вносили NADH или NADPH (Sigma, США) и регистрировали ответ в течение не менее 20 мин. Из хемилюминограммы определяли уровни стимулированной хемилюминесценции АNADH и АNADPH (рис. 1), которые отражают активность NADH-зависимой цитохром b5-редуктазы и NADPH-зависимой цитохром Р450-редуктазы соответственно.

Статистическая обработка. Статистическую обработку проводили при помощи пакета STATISTICA (StatSoft, США). Использовали критерий Шапиро – Уилка для оценки нормальности распределения. Описательную статистику приводили в виде медианы и межквартильного размаха. Различия между группами оценивали по непараметрическому критерию Манна – Уитни (уровень значимости p = 0,05).

Рис. 1. Хемилюминограммы NADH- и NADPH-зависимого ответа гомогената тканей придатков яичек крыс из контрольной группы; момент добавления стимулов указан стрелкой, приведен принцип определения амплитуд

Результаты исследования и их обсуждение

В исследовании применен метод люцигенин-активированной хемилюминесценции суспензии клеток в присутствии стимулов – восстановительных эквивалентов NADH и NADPH, которая, согласно данным литературы, вызвана продукцией супероксидного анион-радикала, образующегося в результате восстановления люцигенина NADH-зависимой цитохром b5-редуктазой и NADPH-зависимой цитохром Р450-редуктазой [7, 8].

По критерию Шапиро – Уилка, основная часть данных не подчиняется закону нормального распределения (p < 0,05), поэтому описательную статистику приводили в виде медианы и межквартильного размаха. В итоге были получены две совокупности данных, отражающие: а) активность NADPH-зависимой цитохром 450-редуктазы, б) активность NADH-зависимой цитохром b5-редуктазы сперматозоидов (таблица, рис. 2).

Интенсивности NADH- и NADPH-стимулированного ответа у интактных крыс были сопоставимы по величине, однако кинетика NADH-зависимой хемилюминесценции развивалась существенно быстрее (рис. 1).

Амплитуды стимулированной хемилюминесценции АNADH и АNADPH по группам животных

Рис. 2. Гистограммы (а) NADH- и (б) NADPH-зависимого ответа гомогенатов тканей придатков яичек крыс из контрольной группы (Контроль), из групп с моделированием экспериментального крипторхизма без лечения (Крипторхизм) и после лечения кломифеном (Кломифен)

По активности CYB5R группы контроля и крипторхизма не различались значимо, хотя медиана в последней оказалась ниже. Значимые различия по NADH-зависимому ответу были получены для групп животных с моделированием экспериментального крипторхизма без лечения и после терапии кломифеном (p = 0,05). Значимые различия по NADPH-зависимому ответу были получены для группы контроля по сравнению как с группой моделирования экспериментального крипторхизма (p = 0,03), так и группой животных с крипторхизмом, которым проводили терапию кломифеном (p = 0,03).

Таким образом, экспериментальный крипторхизм приводил к снижению активности как CYB5R, так и CYPOR, причем влияние на CYPOR было более выраженным. Терапия кломифеном не приводила к восстановлению активности CYB5R и CYPOR.

Для исследования активности CYB5R и CYPOR была выбрана модель бесплодия, обеспечивающая повреждение нескольких типов клеток яичка, но при этом являющаяся обратимой. Экспериментальная модель крипторхизма связана с воздействием на клетки семенников повышенной температуры в брюшной полости крысы, приводящей к нарушениям активности ряда ферментов, участвующих в дифференцировке клеток сперматогенного эпителия, уменьшается экспрессия специфической для яичек Na+/K+-АТФазы, регулирующей подвижность и капацитацию сперматозоидов [9]. Гипертермия пагубно воздействует на клетки Сертоли и стероидогенез в клетках Лейдига, в которых к увеличивается продукция эстрадиола и снижается продукция тестостерона, что нарушает физиологию сперматогенеза [10]. При крипторхизме также развивается окислительный стресс, являющийся одной из причин сниженной продукции тестостерона. Окислительный стресс при крипторхизме коррелировал с повышенным уровнем апоптоза и изменениями в экспрессии генов, вовлеченных в энергетический и липидный метаболизм и стрессорный ответ [11].

Система цитохрома b5 является важнейшим участником функционирования в клетках Лейдига. В частности, CYB5R участвует в поддержании на необходимом уровне коэнзима Q10 в восстановленной форме, являясь, таким образом, частью антиоксидантной системы. Изменение активности CYB5R сперматозоидов при крипторхизме может свидетельствовать об истощении этой системы, возможно, вследствие внутриклеточного окислительного стресса. Либо, наоборот, снижение активности этой системы может быть одной из причин окислительного стресса.

CYPOR вместе с цитохромом P450 является компонентом микросомального ферментного комплекса ароматазы, который в семенниках млекопитающих локализован в клетках Лейдига, Сертоли и в сперматозоидах [12]. Ароматаза участвует в конечном этапе необратимого синтеза эстрогенов из андрогенов, резервуарами для которых из-за высокого содержания липидов являются митохондрии. Окислительный стресс, который развивается при митохондриальной дисфункции, пагубно влияет на эндоплазматический ретикулум [13], при этом образуются белки с дефектной структурой, что приводит к снижению функции сперматозоидов или апоптозу [14]. В группе экспериментального крипторхизма снижение активности CYPOR было более выраженным, чем CYB5R, что свидетельствует о большей чувствительности этой системы к нарушению условий созревания сперматозоидов. Возможно, причиной снижения активности CYPOR является окислительный стресс, развивающийся при крипторхизме и приводящий к окислительной модификации белков [15].

В целом в модели экспериментального крипторхизма активность обеих микросомальных редуктаз была снижена, что может стать мишенью новых терапевтических подходов. Терапия кломифеном не оказала благоприятного эффекта на активность CYB5R и CYPOR, видимо, это повреждение при крипторхизме является необратимым.

Заключение

Нарушение температурного режима созревания сперматозоидов при экспериментальном крипторхизме приводит к снижению активности микросомальных редуктаз сперматозоидов, причем фермент CYPOR, участвующий в синтезе эстрогенов, более чувствителен к гипертермии. Вероятно, одной из причин снижения активности CYB5R и CYPOR является окислительный стресс, развивающийся при крипторхизме. Несмотря на то, что модель крипторхизма считается обратимой, активность микросомальных редуктаз не восстанавливается при терапии кломифена цитратом, что делает целесообразным рассмотрение возможного сочетанного применения кломифена цитрата с антиоксидантной терапией или иной терапией, направленной на восстановление активности микросомальных редуктаз.