Одним из приоритетных направлений развития сельскохозяйственного сектора во всем мире является животноводство, сдерживающим фактором развития которого является недостаточность кормовой базы [1]. Возможным путем решения этой проблемы является повышение урожайности кормовых культур [2]. Основной кормо-бобовой культурой является люцерна, которую возделывают на зерно и зеленую массу. Не менее важной культурой является донник, который хорошо растет и развивается на засоленных почвах и является перспективным фитомелиорантом. Трава люцерны и донника характеризуется высоким содержанием протеина, в состав которого входят основные незаменимые аминокислоты (лизин, валин, триптофан, метионин и др.). Содержание этих аминокислот в белке донника и люцерны в 1,5–3,0 раза выше, чем в белке зерновых [3]. Также кормо-бобовые культуры активно фиксируют азот атмосферы и оставляют его с пожнивными остатками в почве (до 40–100 кг азота на гектар, что приравнивается к 10–20 т/га навоза) [4]. Можно сказать, что выращивание донника и люцерны способствует повышению плодородия почв, приводит к накоплению биологического азота и гумуса в почве и обеспечивает структурирование почвы [5]. В будущем эти культуры будут занимать ведущее место в органическом земледелии для поддержания плодородия почв [6].
Однако при выращивании этих культур существует проблема плохой всхожести семян, что связано с биологической особенностью их строения. Часть семян донника и люцерны (30–70 %) имеет твердую, непроницаемую для воды оболочку, поэтому они не могут прорастать сразу после посева [7]. Это свойство называется твердокаменностью семян. Из-за твердой оболочки семена при высеве не дают дружных всходов, что создает разреженность посевов и значительно снижает урожайность зеленой массы этих культур с единицы площади [8].
Проблемой снижения твердокаменности семян кормо-бобовых культур занимаются США, Индия, Китай, многие страны Европы и Латинской Америки, Россия и др. Разработаны и применяются физические, химические и механические способы повышения всхожести семян этих культур [9, 10]. В сельском хозяйстве на практике наиболее часто применяют механическую скарификацию, при которой твердую оболочку семян разрушают, пропуская их через специальные машины-скарификаторы [11]. Этот метод требует специального оборудования, больших затрат энергии и труда. Кроме того, механическое воздействие вызывает повреждение не только оболочки, но и зародыша семени, что приводит к его поражению микробами, плесневению, загниванию проростков, и значительная часть посевного материала пропадает [12]. В этой связи разработка доступного, экологически чистого и эффективного способа повышения всхожести семян кормо-бобовых культур очень актуальна. Всем этим требованиям отвечает биологический способ повышения всхожести семян, основанный на использовании специально селекционированных микроорганизмов – целлюлолитических бактерий. Эти бактерии синтезируют особые ферменты – целлюлазы, которые частично разрушают целлюлозу твердой оболочки семян, образуя в ней микротрещины. Нарушенная оболочка становится более легкой для прорастания зародыша, тем самым повышается всхожесть семян. Применение биологического способа более эффективно, чем механическая скарификация, так как бактерии обладают избирательным действием – частично разрушают только твердую оболочку и не повреждают семядоли и зародыш семян. Способ не требует специального оборудования и больших энергетических и материальных затрат.
Для разработки биологического способа необходимо изучить влияние целлюлолитических бактерий на всхожесть семян, стимуляцию роста и развития донника и люцерны и отобрать наиболее эффективные штаммы. На основе способа в дальнейшем планируется разработка биоудобрения для повышения всхожести семян и стимуляции роста кормо-бобовых культур. Созданное биоудобрение будет отвечать требованиям охраны окружающей среды и способствовать развитию органического сельского хозяйства, так как бактерии, входящие в его состав, являются естественными представителями почвы и участвуют в повышении ее плодородия.
Целью данного исследования является изучение способности целлюлолитических бактерий повышать всхожесть семян, стимулировать рост и развитие растений донника и люцерны, отбор наиболее эффективных штаммов и разработка биологического способа.
Материалы и методы исследования
Объектами исследования служили целлюлолитические бактерии, выделенные из почв и целлюлозосодержащих растительных остатков, собранных на полях донника и люцерны в Алматинской области Казахстана в 2020 г. В опытах использовали два сорта донника «Аркас» и «Желтый» и люцерны (Medicago sativa L.) «Семиреченская» и «Семиреченская новая». Сорт «Аркас» относится к доннику белому (Melilotus albus Medik.) и характеризуется низким содержанием алкалоида кумарина, сорт «Желтый» относится к доннику лекарственному (Melilotus officinalis Pall.) и является отличным медоносом. Все сорта рекомендованы для выращивания в юго-восточном регионе Казахстана и широко используются фермерами.
Культивирование целлюлолитических бактерий проводили в жидкой элективной среде Гетчинсона на шейкере при 180 об/мин и на твердых питательных средах (среда Гетчинсона, МПА) при температуре 28 °С.
Лабораторные опыты по изучению влияния целлюлолитических бактерий на всхожесть семян и рост растений донника и люцерны проводили в климатической камере роста (Constant Climate Chamber HPP-750, «Memmert», Germany). Параметры режима камеры роста: световой день – 12 ч, температура 25 °С, освещенность: холодный белый свет 6500 К, теплый свет 2700 К; ночной режим – 12 ч; температура 15°С, влажность 65 %. Для обработки семян использовали бактериальные суспензии с титром 1×108 кл/мл из расчета 15 мл на 100 г семян. Время обработки семян при комнатной температуре составляло 2 ч. Контролем служили семена, замоченные в стерильной водопроводной воде. Семена высевали в сосуды с почвой на 250 мл. Количество семян составляло 7 растений на сосуд. Длительность опытов составляла 30 дней. Повторность опытов пятикратная. Всхожесть семян определяли посредством подсчета проросших семян в опытах и контроле. Оценку ростостимулирующего действия производили путем измерения длины стебля, корней, подсчета числа листьев на одно растение, обработанных бактериями, и сравнивали их с соответствующими показателями в контроле [13].
Полевые мелкоделяночные опыты проводили в трех областях Казахстана, отличающихся по климатическим и почвенным условиям (Алматинская, Кызылординская и Восточно-Казахстанская области). Семена перед посевом обрабатывали суспензиями бактерий с титром 1×108 кл/мл, из расчета 200–250 мл на гектарную норму семян. Время обработки составляло 2 ч, температура 23–25 °С. Контролем служили семена без обработки.
Титр бактериальной суспензии определяли методом прямого подсчета при высеве на питательные среды [14].
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета программ «STATISTICA 10.0» [15].
Результаты исследования и их обсуждение
Сбор образцов почв и целлюлозосодержащих остатков был проведен в 2020 г. на полях Алматинской области Казахстана, где выращивали донник и люцерну. В общей сложности было собрано 84 образца, из них выделены 54 чистые культуры целлюлолитических бактерий. Проведен первичный скрининг бактерий по признаку целлюлазной активности и отобрано шесть штаммов бактерий с высокой целлюлазной активностью (С-21(18)N, С-21N2, С-21(2)AS, С-22ТN, С-182K, С-604N).
В лабораторных условиях были проведены опыты по изучению влияния отобранных штаммов целлюлолитических бактерий на всхожесть семян и стимуляцию роста донника и люцерны. Полученные данные представлены в табл. 1.
Таблица 1
Влияние целлюлолитических бактерий на всхожесть семян, рост и развитие донника и люцерны в лабораторных опытах
|
Варианты опыта |
Всхожесть семян, % |
Длина стебля, см |
Длина корня, см |
Кол-во листьев, шт. |
Количество корней, шт. |
|
Донник «Аркас» |
|||||
|
Контроль |
36,3 |
7,8±0,1 |
6,1±0,03 |
2,3±0,1 |
1,0±0,1 |
|
С-21(18)N |
77,1 |
14,8±0,2 |
14,3±0,2 |
2,9±0,1 |
2,7±0,2 |
|
С-21N2 |
83,8 |
15,4±0,3 |
15,5±0,2 |
2,9±0,2 |
1,8±0,1 |
|
С-182K |
73,5 |
18,5±0,2 |
15,2±0,1 |
2,7±0,1 |
2,4±0,1 |
|
С-21(2)AS |
76,8 |
12,9±0,1 |
12,5±0,1 |
2,9±0,1 |
1,2±0,1 |
|
С-22ТN |
80,6 |
14,8±0,2 |
15,4±0,1 |
2,3±0,1 |
1,2±0,1 |
|
С-604N |
77,2 |
14,9±0,1 |
13,5±0,2 |
2,1±0,1 |
3,3±0,1 |
|
Донник «Желтый» |
|||||
|
Контроль |
40,3 |
6,2±0,1 |
5,9±0,1 |
1,8±0,1 |
1,1±0,1 |
|
С-21(8)N |
77,2 |
14,8±0,3 |
13,6±0,2 |
2,6±0,2 |
2,1±0,1 |
|
С-21N2 |
79,5 |
16,8±0,2 |
16,9±0,1 |
2,9±0,2 |
1,2±0,1 |
|
С-82K |
80,1 |
16,1±0,3 |
16,7±0,1 |
2,8±0,2 |
2,6±0,2 |
|
С-21(2)AS |
78,2 |
15,6±0,2 |
13,5±0,1 |
2,7±0,1 |
1,9±0,05 |
|
С-22ТN |
83,5 |
12,9±0,1 |
16,8±0,2 |
2,4±0,1 |
1,4 ±0,1 |
|
С-604N |
77,3 |
16,3±0,2 |
13,1±0,1 |
3,1±0,2 |
3,8±0,2 |
|
Люцерна «Семиреченская новая» |
|||||
|
Контроль |
51,3 |
7,0±0,1 |
6,5±0,1 |
2,0±0,1 |
1,2±0,1 |
|
С-21(18)N |
85,2 |
14,7±0,2 |
13,8±0,2 |
2,4±0,1 |
1,6±0,1 |
|
С-21N2 |
90,3 |
17,2±0,3 |
16,4±0,1 |
2,9±0,2 |
1,8±0,1 |
|
С-182K |
89,3 |
17,7±0,1 |
16,5±0,2 |
2,7±0,1 |
1,8±0,1 |
|
С-21(2)AS |
87,5 |
16,7±0,3 |
15,8±0,3 |
2,7±0,2 |
2,5±0,1 |
|
С-22ТN |
90,1 |
13,9±0,2 |
16,8±0,2 |
2,6±0,1 |
2,9±0,2 |
|
С-604N |
77,2 |
17,4±0,2 |
15,7±0,3 |
2,9±0,2 |
1,9±0,1 |
|
Люцерна «Семиреченская» |
|||||
|
Контроль |
49,2 |
6,1±0,1 |
5,4±0,06 |
2,3±0,1 |
1,1±0,08 |
|
С-21(18)N |
80,8 |
15,5±0,3 |
14,6±0,1 |
2,7±0,1 |
1, 7±0,06 |
|
С-21N2 |
90,2 |
17,9±0,2 |
17,4±0,1 |
2,4±0,2 |
1,8±0,04 |
|
С-182K |
87,3 |
17,8±0,2 |
17,9±0,2 |
2,5±0,1 |
1,9±0,05 |
|
С-21(2)AS |
84,6 |
16,7±0,1 |
15,9±0,1 |
2,3±0,2 |
2,8±0,2 |
|
С-22ТN |
89,8 |
16,8±0,2 |
16,9±0,2 |
2,4±0,1 |
1,7±0,05 |
|
С-604N |
79,6 |
14,9±0,2 |
14,7±0,2 |
2,6±0,1 |
1,8±0,04 |
|
Примечание. р < 0,05. |
|||||
Таблица 2
Влияние целлюлолитических бактерий на всхожесть семян, рост и развитие донника и люцерны в полевых опытах
|
Варианты опыта |
Всхожесть, % |
Длина стебля, см |
Длина корня, см |
|
Донник «Аркас» |
|||
|
Контроль |
30,3 |
26,5±0,1 |
24,3±0,1 |
|
С-21(18)N |
76,9 |
59,9±0,2 |
53,8±0,2 |
|
С-182K |
78,2 |
63,2±0,3 |
55,4±0,2 |
|
С-22ТN |
60,0 |
59,2±0,2 |
45,5±0,1 |
|
Донник «Желтый» |
|||
|
Контроль |
28,9 |
25,2±0,3 |
24,5±0,1 |
|
С-21(18)N |
77,9 |
58,9±0,2 |
54,4±0,1 |
|
С-182K |
78,3 |
60,3±0,2 |
55,4±0,2 |
|
С-22ТN |
65,7 |
56,6±0,3 |
52,6±0,2 |
|
Люцерна «Семиреченская новая» |
|||
|
Контроль |
43,2 |
26,5±0,3 |
23,6±0,1 |
|
С-182K |
87,6 |
60,6±0,2 |
47,5±0,2 |
|
С-22ТN |
64,3 |
57,4±0,2 |
45,8±0,2 |
|
С-21(2)AS |
78,6 |
59,7±0,5 |
47,2±0,3 |
|
С-21N2 |
87,3 |
61,2±0,5 |
47,7±0,2 |
|
Люцерна «Семиреченская» |
|||
|
Контроль |
38,6 |
26,2±0,1 |
23,8±0,1 |
|
С-182K |
87,6 |
62,3±0,3 |
50,7±0,2 |
|
С-22ТN |
80,7 |
58,7±0,2 |
47,3±0,2 |
|
С-21(2)AS |
75,0 |
56,8±0,2 |
45,8±0,1 |
|
С-21N2 |
87,5 |
63,5±0,1 |
50,9±0,2 |
|
Примечание. Уровень доверительной вероятности р < 0,05. |
|||
Из данных, приведенных в табл. 1, следует, что штаммы целлюлолитических бактерий значительно повышали всхожесть семян донника и люцерны. При этом всхожесть обработанных семян донника возросла до 83,8 %, в контроле всхожесть донника сорта «Аркас» составляла только 36,3 %, сорта «Желтый» – 40,3 %. Обработка семян люцерны бактериями повышала их всхожесть до 90 %, в контроле этот показатель у сорта люцерны «Семиреченская новая» составлял 51,3 %, а у сорта «Семиреченская» – 49,2 %. Также установлено, что обработка семян бактериями активно стимулировала развитие растений донника и люцерны. При этом длина стебля донника сорта «Аркас» увеличилась в 1,6–2,4 раза, корня – в 2,1–2,5 раза, длина стебля донника сорта «Желтый» – в 2,0–2,7, корня – в 2,2–2,9 по сравнению с контролем. Длина стеблей люцерны, обработанных бактериями, у сорта «Семиреченская новая» и «Семиреченская» увеличилась в 2,0–2,5 и 2,4–2,9 раза, корня – в 2,1–2,6 и 2,7–3,3 раза соответственно по сравнению с контролем. По результатам исследований были отобраны активные штаммы бактерий: три штамма (С-21(18)N, С-182K и С-22ТN) для донника и четыре штамма (С-21N2, С-182K, С-21(2)AS и С-22ТN) для люцерны.
Поскольку планируется применение биологического способа в полевых условиях с разными климатическими и почвенными характеристиками, полевые мелкоделяночные опыты были проведены в трех областях Казахстана – Алматинской, Кызылординской и Восточно-Казахстанской, существенно отличающихся по своим почвенно-климатическим условиям. Для инокуляции семян использовали шесть штаммов целлюлолитических бактерий, отобранных в лабораторных опытах. В табл. 2 приведены результаты наиболее эффективных штаммов целлюлолитических бактерий.
Из данных, приведенных в табл. 2, следует, что полевая всхожесть семян донника сортов «Аркас» и «Желтый» была очень низкой – 30,3 и 28,9 % соответственно. При обработке семян штаммами бактерий их всхожесть увеличилась до 78,2 и 78,6 %. При этом длина стебля увеличилась в 2,2–2,4 раза, а корней – в 1,9-2,3 раза. Полевая всхожесть семян люцерны сорта «Семиреченская новая» составила 43,2 %, а сорта «Семиреченская» – 38,6 %. Обработка семян люцерны суспензией бактерий повысила их всхожесть до 87,6 %. При этом длина стеблей сорта «Семиреченская новая» увеличилась в 2,2–2,3 раза, корней – в 1,9–2,0 раза, а длина стеблей сорта «Семиреченская» – в 2,2–2,4 раза, корней в 1,9–2,1 раза по сравнению с контролем. Наиболее эффективно повышали всхожесть и стимулировали развитие донника штаммы С-21(18)N и С-182K, а люцерны – штамм С-21N2. Однако отмечено, что штамм С-182K также активно повышает всхожесть семян и стимулирует развитие люцерны, и его можно использовать под культуру люцерны.
Заключение
Таким образом, проведены лабораторные и полевые исследования по влиянию целлюлолитических бактерий на всхожесть, рост и развитие кормо-бобовых культур донника и люцерны. Установлено, что предпосевная инокуляция семян сортов донника и люцерны повышала их полевую всхожесть до 87,0 % и существенно стимулировала их развитие. При этом длина стеблей и корней увеличивалась более чем в 2,0 раза. По результатам лабораторных и полевых испытаний отобраны три наиболее эффективных штамма целлюлолитических бактерий – два штамма для донника С-21(18)N и С-182K и один штамм для люцерны С-21N2. На основе этих штаммов целлюлолитических бактерий разработан биологический способ повышения всхожести семян, стимуляции роста кормо-бобовых культур донника и люцерны.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Республики Казахстан, в рамках грантового проекта ИРН AP08855656.