Применение биосовместимых и биоразлагаемых материалов в медицине обусловливает новые требования к таковым. Разработка новых способов использования биополимеров формирует потребность в материалах, которые бы четко соответствовали запросам специалистов каждой области медицины, а также давали возможность точной настройки их свойств для адаптации к нуждам отдельных пациентов. Одним из подобных материалов, не первое десятилетие привлекающим внимание исследователей, является хитозан. На основе хитозана создаются многочисленные композитные и биокомпозитные материалы, включающие биологические, синтетические и минеральные соединения. За счет этого возможно получение продуктов, обладающих широким спектром свойств и пригодных, в том числе, для медицинского применения.
Цель работы – рассмотрение способов функционализации продуктов на основе хитозана для использования в медицине. При этом акцент будет сделан на использование биокомпозитных материалов, содержащих сочетание хитозана и структурных белков организма животных и человека.
Хитозан-ламинин
Одной из добавок к хитозану являются ламинин или полученные из него пептиды. Ламинин – гликопротеин внеклеточного матрикса, содержащийся в организме всех животных. Семейство ламининов составляет основу состава базальной ламины и играет ключевую роль в ее биологической активности, включая обеспечение адгезии, миграции и дифференциации клеток. Это делает ламинин неотъемлемой частью структурных компонентов органов и тканей, жизненно необходимой для осуществления их функций. В организме человека ламинины образуют независимые от коллагенового каркаса структуры, однако ассоциированы с коллагеном IV типа за счет вспомогательных белков и гликопротеидов. Также посредством взаимодействия с такими мембранными белками, как интегрины, ламинины связываются с клеточной мембраной, что и обусловливает их роль в регуляции взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом. Присутствие ламининов является важным условием протекания ряда клеточных процессов in vitro и in vivo, и введение ламининов в искусственные биокомпозитные скаффолды значительно изменяет их биологические свойства. Хитозановые мембраны, модифицированные ламинином, используются в основном для регенерации нервной ткани и заживления ран [1-3]. Добавление ламинина или его пептидов увеличивает рост аксонов в культуре клеток PC12 [4]. Кроме того, оно повышает адгезию и миграцию фибробластов, а также кератиноцитов кожи человека [4, 5].
Так, Mochizuki и соавторы демонстрируют, что добавление к хитозановым мембранам четырех биологически активных пептидов на основе ламинина способствовало улучшению адгезии фибробластов человека. Три из изученных данным коллективом пептидов также способствовали активному прикреплению клеток HT-1080 к модифицированному матриксу. Также данные пептиды, по данным авторов, увеличивают рост аксонов в опыте с клетками PC12 [6]. Сходные данные о продуктах на основе хитозана и ламинина были также получены другими коллективами авторов [7, 8].
Помимо этого, также известно, что ламинин способствует пролиферации стволовых клеток костного мозга [9]. Одним из традиционных подходов к стимуляции заживления ран является использование стволовых клеток костного мозга или продуктов их жизнедеятельности, что указывает на потенциальную ранозаживляющую активность хитозан-ламининовых мембран.
Также ламинин добавляют в коллаген-хитозановые каркасы. Подобные композитные продукты могут применяться в тканевой инженерии кожи, позволяя достичь улучшенной иннервации образующихся тканей in vivo [10]. В свою очередь, McEwan и соавторы исследовали возможность использования композитных матриксов ламинин-коллаген-хитозан для создания химерной инсулин-продуцирующей ткани in vitro. Данным коллективом был сделан вывод, что добавление ламинина в гидрогели способствует кратковременной выживаемости клеток САС (циркулирующие ангиогенные клетки). Это возможно из-за того, что RGD-пептид ламинина создает место для прикрепления клеток САС, улучшая их жизнеспособность и, тем самым, способность тканеинженерного тканеинженерного конструкта к ангиогенезу [11].
В тканевой инженерии активно применяются композитные материалы из углеродных (карбоновых) нанотрубок с хитозаном [12, 13, 14]. Ламинин находит свое применение и в таких продуктах. Добавление ламинина приводило к улучшению адгезии клеток и роста аксонов [15, 16].
Хитозан-кератин
Кератин – представитель класса фибриллярных белков, являющийся основным компонентом волос, ногтей, перьев, чешуек и роговых образований, а также внешнего слоя кожи у позвоночных. Кератин крайне слаборастворим в воде и органических растворителях и придает высококератинизированным тканям значительную твердость. Кератин с успехом используется в качестве добавки к различным хитозановым изделиям для регенеративной медицины. Добавление кератина к хитозану улучшает как физические свойства продукта, так и биосовместимость. Из хитозана и кератина изготавливают нетканые перевязочные материалы, нановолокна, композитные материалы и микрокапсулы [17, 18, 19].
Islam и соавторы предлагают создание нановолоконного каркаса из поливинилового спирта, кератина и хитозана. Данный каркас был изготовлен путем электроспиннинга. Было выявлено, что включение кератина приводило к увеличению биодеградации. Также было доказано что при увеличении доли хитозана и кератина в смеси увеличивалось набухание каркасов [18].
Deng и соавторы предлагают создание шовных материалов из поликапролактона и полиэтиленгликоля с добавлением хитозана и кератина методом экструзии горячего расплава. В данном исследовании были доказаны отсутствие цитотоксичности и увеличение пролиферации клеток HaCat на данных волокнах. Добавление хитозана и кератина способствовало увеличению прочности волокна на разрыв [20].
Другое направление применения хитозана и кератина – это создание каркасов из нановолокна [21, 22]. Так, Singaravelu и соавторы предлагают создание методом электроспиннинга двухслойного каркаса, первый слой которого состоит из поли-3-гидроксимасляной кислоты и желатина, а второй слой – из кератина и хитозана. Данный каркас продемонстрировал увеличение адгезии и пролиферации клеток NIH 3T3 и HaCaT, а также сохранение ими высокой жизнеспособности. Аминокислотные последовательности, характерные для кератина (RGD (Arg-Gly-Asp), LDV (Leu-Asp-Val)), способствуют более легкой клеточной адгезии и пролиферации [23].
Помимо волокна, кератин-хитозановые композиты могут использоваться для получения и других видов продуктов [24, 25]. Так, Lin и соавторы утверждают, что добавление кератина к хитозану увеличивает адгезию, пролиферацию и миграцию клеток L929. Хитозан, в свою очередь, влияет на физические свойства каркасов, улучшая механическую прочность. Все это указывает на то, что данный материал может использоваться для изготовления раневых покрытий [26].
Кроме применения в лечении ран, хитозан-кератиновые пленчатые каркасы используются в тканевой инженерии роговицы человека [27, 28]. Потенциал применения кератин-хитозановых пленок подтверждается ранними успехами, достигнутыми при культивировании клеток роговицы на хитозановых и кератиновых матриксах по отдельности [29, 30]. Также подобные биокомпозиты были применены для восстановления периферических нервов и в качестве буккального мукоадгезивного пластыря для лечения гингивита [31, 32]. Следует отметить, однако, что данные направления исследования подкреплены крайне малым количеством опубликованных экспериментальных данных.
Хитозан-Матригель
Матригель представляет собой имитацию базальной мембраны или внеклеточного матрикса, секретируемую клетками саркомы мыши Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), производимую Corning Life Sciences. Из-за своих свойств матригель находит широкое применение в биоинженерии. Ряд авторов предлагают создание различных продуктов из хитозана совместно с матригелем. Матригель и его аналоги применяются как самостоятельные добавки, используемые для выращивания высокочувствительных культур клеток [33, 34, 35].
Так, Xue и соавторы предлагают создание перевязочного материала из хитозана, матригеля и полиакриламида. Перевязочный материал демонстрирует высокую степень набухания, хорошую адгезию и низкую цитотоксичность по отношению к фибробластам L929, также он улучшает заживление ран за счет повышения экспрессии противовоспалительных и снижения экспрессии провоспалительных факторов [36].
Другие же авторы предлагают создание каркаса из хитозана и матригеля. Повышение концентрации хитозана в подобных каркасах увеличивает упругость, но клетки проявляют меньшую хондрогенную активность. Добавление матригеля позволяет сохранить хондрогенную активность и дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток костного мозга [37].
Помимо этого, хитозан и матригель используются в биопечати. Так, Liu и соавторы предлагают создание биочернил из хитозана, производных гиалуроновой кислоты и матригеля. Данные биочернила демонстрируют быстрое гелеобразование в течение 20 секунд. Каркасы, созданные из таких биочернил, поддерживают высокую жизнеспособность стволовых клеток нервной ткани NSC и создают благоприятную микросреду, которая увеличивает дифференцировку нейронов. Эксперименты in vivo продемонстрировали способность подобных каркасов стимулировать регенерацию аксонов и снижать глиальное рубцевание [38].
Вопрос о совместном применении хитозана и матригеля изучен очень слабо. Но применение матригеля отдельно от хитозана широко изучено. Так, ряд авторов предлагают применение матригеля с коллагеном [39, 40]. Добавление матригеля к коллагеновому гелю улучшает механическую стабильность каркаса. В таких условиях клетки проявляют сопоставимую с чистыми коллагеновыми гелями жизнеспособность и пролиферацию [41].
Хитозан-Эластин
Эластин представляет собой белок соединительной ткани. В организме млекопитающих эластин синтезируется фибробластами и находится в межклеточном веществе соединительной ткани. Эластин помогает органам и тканям поддерживать форму. Из-за своих свойств эластин нашел применение в регенеративной медицине, в том числе в составе хитозан-эластиновых композитов [42, 43].
Добавление эластина к хитозану улучшает механическую прочность и ударную вязкость [44]. Продукты из хитозан-эластина применяются для инженерии хрящевой ткани. Так, Kuo и соавторы предлагают создание каркаса из хитозана и поли-γ-глутаминовой кислоты методом сшивания генипином с последующей лиофилизацией. Поверхность каркасов дополнительно модифицировали альбумином плазмы человека, эластином и поли-L-лизином в различных сочетаниях. Модификация каркасов повышала по сравнению с необработанными матриксами адгезию и пролиферацию бычьих хондроцитов, а также секрецию ими молекул межклеточного матрикса (гликозаминогликана и коллагена II типа) [45].
Помимо этого, хитозан-эластиновые биокаркасы используются в инженерии тканей кожи. Так, Zehra и соавторы предлагают создание каркасов из хитозана, альгината натрия и эластина с добавлением нестероидного противовоспалительного средства. Полученные каркасы обладали удовлетворительными физическими свойствами – пористостью, водопоглощением и скоростью деградации, необходимыми для инфильтрации клеток в каркас, а также для поглощения раневого экссудата. Исследования in vitro также указывают на то, что данные каркасы не цитотоксичны стволовых клеток жировой ткани (ASC) и обеспечивают условия для адгезии и миграции данных клеток в поры [46].
Следует отметить, что применение эластина совместно с хитозаном изучено мало. Это может быть связано с тем, что продукты на основе хитозан-эластина не обладают свойствами, которыми бы не обладали продукты на основе композитов хитозана с другими, более доступными для изучения белками.
Заключение
Хитозан активно изучается учеными в различных направлениях. Одним из направлений является применение хитозана в регенеративной медицине в качестве полимера для создания клеточных каркасов. Однако свойств одного лишь хитозана без добавок часто недостаточно для достижения желаемого эффекта. Использование различных добавок к хитозану позволяет расширить спектр его применения – от использования в регенеративной медицине до изготовления упаковочного материала. Исследователи активно ищут полимеры, которые могли бы улучшать свойства хитозана. Так, ведется множество исследований в области добавления в хитозановые каркасы различных биополимеров, в том числе и структурных белков. В данном обзоре были рассмотрены композиты с добавлением ламинина, кератина и эластина, а также композиты хитозана с матригелем.
Биодеградируемые композитные материалы являются перспективным объектом исследований в области тканевой инженерии и регенеративной медицины, при этом включение структурных белков может открывать для них новые области биомедицинского применения, не достижимые композициями с другим составом.
Работа выполнена в рамках гранта Губернатора Алтайского края в форме субсидий для разработки качественно новых технологий, создания инновационных продуктов и услуг в сферах переработки и производства пищевых продуктов, фармацевтического производства и биотехнологий в соответствии с пунктом 4 статьи 78.1 Бюджетного кодекса Российской Федерации по теме «Разработка технологии получения биологически активного культурального клеточного матрикса» (соглашение № 5 от 12 апреля 2022 года).
Партнер проекта – ООО Диаэм.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.