Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Бронхиолярные экзокриноциты (БЭ), также известные как булавовидные клетки (club cells, CCs-клетки) или клетки Клара, – это безреснитчатые кубические или цилиндрические эпителиальные клетки, выстилающие самые дистальные отделы воздухоносных путей и респираторные бронхиолы. У крыс они значительно выступают в просвет бронхиол своей апикальной частью, напоминающей булаву. В норме в общей популяции клеток бронхиолярного эпителия у крысы количество БЭ в терминальных бронхиолах в два раза меньше, чем в респираторных бронхиолах, а в проксимальных воздушных путях они практически отсутствуют [1].

На сегодняшний день выяснено, что БЭ являются многофункциональными клетками, хотя окончательно их функции не определены, поскольку не известен полностью состав секрета, который они синтезируют и выделяют в просвет бронхиол. Среди установленных функций БЭ следует упомянуть секреторную функцию, а именно их участие в образовании бронхиолярного секрета, благодаря перемещению которого осуществляется бронхиолярный мукоцилиарный клиренс. Помимо этого, БЭ секретируют компоненты сурфактанта, а также различные белки, ингибирующие выделение лейкоцитами провоспалительных веществ и хемотаксис фибробластов [2, 3, 4]. Не менее важной функцией БЭ является обеспечение метаболизма канцерогенных веществ и ксенобиотиков, что, по выражению В.Л. Горячкиной, позволяет считать БЭ своего рода цитоэкологическим форпостом, защищающим респираторный отдел легкого от загрязнения [5]. Ну и, пожалуй, еще одна их значимая функция – участие в качестве стволовых клеток в обновлении собственной популяции, а также популяции реснитчатых клеток, как в нормальных физиологических условиях, так и при патологических воздействиях на эпителий бронхов [6, 7].

В настоящее время одним из наиболее активно изучаемых патологических воздействий на гистофизиологию легких является введение в организм различными путями наночастиц диоксида кремния (НЧДК) разного размера [8, 9, 10]. Однако следует заметить, что особенности изменений структурной организации и численности БЭ при их воздействии не изучены вовсе. В связи с этим целью настоящего исследования является анализ морфофункциональной реорганизации и динамики морфометрических показателей БЭ в легком крыс в течение 6 месяцев после однократного парентерального введения НЧДК размером 7, 12 и 34 нм.

Материал и методы исследования

Исследование проведено на 80 самцах крыс стока Wistar, соматически здоровых, массой 220–250 г (ФГУП «ПЛЖ «Рапполово», Россия), содержавшихся в стандартных условиях вивария конвенциональной категории. Животные были разделены на 4 группы: 1) контрольная (n=20) – с введением 1 мл физиологического раствора (К); 2) экспериментальная группа 1 (n=20) – с введением 1 мл суспензии НЧДК размером 7 нм (официнальный препарат «Полисорб-МП», АО «Полисорб», Россия) в физиологическом растворе (ЭГ1); 3) экспериментальная группа 2 (n=20) с введением 1 мл суспензии НЧДК размером 12 нм («Аэросил-200», Россия) (ЭГ2); 4) экспериментальная группа 3 (n=20) – с введением 1 мл суспензии НЧДК размером 34 нм («Белая сажа БС-100», ООО «Товесорб», Россия) в физиологическом растворе (ЭГ3). Во всех экспериментальных случаях суспензию НЧДК вводили однократно из расчета 7 мг/кг массы тела животного в концентрации 2 мг/мл в хвостовую вену в объеме 1 мл. Для проведения экспериментов in vivo использовались препараты высокой степени чистоты, применяемые в фармацевтической и пищевой промышленности. Манипуляции с животными проводили в условиях анестезии препаратом Золетил (6 мг/кг), вводимым внутрибрюшинно. При экспериментальных исследованиях руководствовались приказом Минздрава России от 01.04.2016 г. № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики» и рекомендациями Этического комитета ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России. Материал забирали на 21-е сутки, через 2, 4 и 6 месяцев после введения НЧДК, по 5 животных в группе. Для получения сопоставимых результатов образцы обрабатывали параллельно и в одинаковых условиях. Получали фронтальный срез доли левого легкого, растянутого при фиксации 10% формалином (рН 7,4). Для гистологического анализа использовали парафиновые срезы толщиной 5 мкм, изготовленные с помощью микротома Accu-Cut SRT 200 (Sakura, Япония), окрашенные гематоксилином и эозином и по методу Маллори («Биовитрум», Россия).

Морфологическое исследование проводили при помощи светового микроскопа Leica DM750 (Leica, Германия), цифровой фотокамеры ICC50 (Leica, Германия) и прикладной компьютерной программы анализа изображений ImageScope Color (версия M). Содержание соединительной ткани в респираторном отделе легкого оценивали визуально. На каждом срезе определяли 10 полей зрения, содержащих респираторную или терминальную бронхиолу, в которой проводили измерение длины респираторного эпителия (Lэ, мкм) и подсчет БЭ в этом эпителии (Nабс.) с дальнейшим пересчетом их числа на 1000 мкм (Nотн.) по формуле: Nотн. = (Nабс. / Lэ) × 1000. БЭ считали низкопризматические клетки с куполообразной апикальной частью, значительно выступающие в просвет бронхиолы. У 20 БЭ с каждого препарата определяли площадь клетки (Sкл, мкм2) и площадь ядра (Sя, мкм2). Полученные данные использовали для расчета площади цитоплазмы (Sц, мкм2) по формуле: Sц = Sкл – Sя и ядерно-цитоплазматического отношения (ЯЦО) по формуле: ЯЦО = Sя / Sц. Статистическую обработку проводили с использованием стандартного пакета Statistica 7.0 Stat. Soft for Windows по группам. Объем выборки в каждой группе для подсчета относительного числа БЭ – 50 элементов (5 животных в группе, 10 полей зрения с 1 микропрепарата), для подсчета площади клетки, площади ядра клетки, ЯЦО – 100 элементов (5 животных в группе, 20 клеток с 1 микропрепарата). Распределение данных в каждой группе соответствует нормальному, что подтверждено по W-критерию Шапиро–Уилка с вероятностью ошибки <0,05. Для оценки достоверности различий количественных данных между группами экспериментальных животных использовали U-критерий Манна–Уитни. Значимыми считали различия при p<0,01.

Результаты исследования и их обсуждение

Как у животных группы К, так и у животных всех экспериментальных групп просвет терминальных и респираторных бронхиол чистый, в просвете единичных бронхиол встречаются отдельные редкие макрофаги и слущенные эпителиальные клетки. Однослойный кубический эпителий во всех бронхиолах без изменений, собственная пластинка без признаков воспалительной реакции (рисунок). На всех сроках эксперимента не было обнаружено признаков соединительнотканного ремоделирования слизистой оболочки бронхиол.

В ЭГ1 относительное число БЭ в эпителии соответствует таковому в группе К и не изменяется на всех сроках эксперимента. Однако Sкл и Sя значимо снижаются уже на 21-е сутки эксперимента и остаются пониженными на всех экспериментальных сроках, при этом также значимо снижается ЯЦО на 21-е сутки, через 2 и 4 месяца эксперимента. На 6-м месяце эксперимента данный показатель соответствует значению в группе К (таблица, рисунок).

В ЭГ2 и ЭГ3 относительное число БЭ также не изменяется по сравнению с данным показателем в группе К. Sкл на всех сроках эксперимента не отличается от контрольных значений (таблица).

Но стоит отметить, что Sя в ЭГ2 и ЭГ3 значимо уменьшается по сравнению с показателями в группе К практически на всех сроках эксперимента. Однако расчет ЯЦО показывает значимое снижение этого показателя в ЭГ2 и ЭГ3 только на 21-е сутки эксперимента (таблица).

Статистический анализ полученных данных показывает также значимое уменьшение ЯЦО в ЭГ1 относительно данного показателя в ЭГ2 и ЭГ3 на 2-м и 4-м месяце эксперимента.

Динамика показателей объектов морфометрии в терминальных и респираторных бронхиолах после введения наночастиц диоксида кремния различного размера

* – показатели статистически значимо отличаются от таковых в контрольной группе с вероятностью ошибки р<0,01.

** – показатели статистически значимо отличаются от таковых в экспериментальных группах ЭГ2 и ЭГ3 с вероятностью ошибки р<0,01.

Респираторная бронхиола и альвеолы Контрольная группа (А, Б); экспериментальная группа (SiO2 7 нм) (В, Г). Стрелки на бронхиолярные экзокриноциты. Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение: (А, В) х 100; (Б, Г) х 400

Известно, что ЯЦО является важнейшей морфологической характеристикой, с помощью которой оценивается уровень метаболической активности клеток [11]. Анализ полученных данных показал, что в ЭГ1 происходит значимое понижение ЯЦО на всех экспериментальных сроках, кроме 6 месяцев. В то же время в ЭГ2 и ЭГ3 ЯЦО значимо снижено только на 21-е сутки эксперимента. Таким образом, согласно нашим данным, однократное парентеральное введение НЧДК в ЭГ1 приводит к существенному долгосрочному снижению синтетической и секреторной функции БЭ, в то время как в ЭГ2 и ЭГ3 – к краткосрочному снижению функциональной активности. Это свидетельствует о большей токсичности НЧДК меньшего размера, что согласуется с данными об их влиянии на макрофаги с развитием асептического воспаления в интерстиции респираторного отдела [12, 13, 14]. Также полученные данные показали, что ни в одной группе на всем протяжении эксперимента не меняется относительное число БЭ, что указывает на отсутствие массовой гибели БЭ при введении НЧДК всех исследуемых размеров.

Заключение

Нами показано, что однократное парентеральное введение НЧДК размерами 7 нм, 12 нм и 34 нм не приводит к изменению численности БЭ на протяжении 6 месяцев, что свидетельствует, по-видимому, об отсутствии стимуляции НЧДК пролиферативной активности у БЭ. При этом НЧДК 7 нм вызывают наибольшую и долговременную морфофункциональную реорганизацию БЭ в терминальных и респираторных бронхиолах, что, безусловно, доказывает наличие токсического эффекта у НЧДК этого размера. Полученные результаты указывают на необходимость дальнейшего изучения влияния НЧДК различных размеров на популяции разных клеток в легких и на более длительных сроках. Таким образом, невозможно говорить о безопасности парентерального введения НЧДК для тканей легкого, несмотря на отсутствие существенных нарушений структурной организации БЭ и признаков пневмофиброза.

Список сокращений: НЧДК – наночастицы диоксида кремния, ЯЦО – ядерно-цитоплазматическое отношение, БЭ – бронхиолярные экзокриноциты.