Одним из важных элементов лечения распространенного перитонита является эффективная санация брюшной полости. В настоящее время для санации брюшной полости наряду с антибиотиками применяются различные антисептики: гипохлорит натрия, озон, перфторан и другие окислители, композиции на основе серебра, монооксид азота и другие газы, обладающие антимикробным действием [1, 2].
Было установлено, что простейшее химическое соединение – оксид азота (NO) непрерывно продуцируется в организме человека и животных ферментативным путем при участии NO-синтазы (NOS), выполняя функции универсального регулятора разнообразных биологических и физиологических процессов [3, 4]. Как регулятор оксид азота участвует в регуляции тонуса кровеносных сосудов, выступая в качестве вазорелаксирующего фактора. Он подавляет агрегацию тромбоцитов и их адгезию на стенках сосудов [5]. Значение эндогенного монооксида азота при воспалении связано с его антимикробным эффектом [6].
Для оценки эффекта NO-терапии на ткани при перитоните [6, 7, 8], помимо общепринятых индикаторов оценки эндотоксикоза (ЛИИ, МСМ, эффективной концентрации альбумина), особую ценность представляют специфические показатели перитонита в крови и перитонеальном экссудате, свидетельствующие о степени микробного повреждения кишечника. Среди таких индикаторов представляют интерес кишечная изоформа щелочной фосфатазы, лизоцим и сходный с кальпротектином и лактоферрином пептид лактоферрицин [9, 10, 11]. Лактоферрин – железосвязывающий белок, который является компонентом иммунной системы организма и имеет первостепенное значение для антибактериальной защиты [12, 13]. Лактоферрин ингибирует бактериальный рост как путем связывания свободного железа, так и опосредованно через эффекты бактерицидного пептида лактоферрицина (ЛФЦ). Этот бактерицидный домен за счет специфического распределения заряженных участков по поверхности макромолекулы образует сайт связывания для бактериального липополисахарида (LPS) [10, 12]. По литературным данным, ЛФЦ в 9 раз эффективнее в уничтожении бактерий, чем интактный лактоферрин [10].
Учитывая, что у известного фермента щелочной фосфатазы (ЩФ) существует специфическая кишечная изоформа (КЩФ), активность которой повышается при различной хирургической патологии, в частности при бактериальных инфекциях, представляется полезным включение этого диагностического показателя в комплекс биохимических индикаторов при изучении экспериментального бактериального перитонита [14, 15].
Цели исследования – определение улучшения результатов лечения бактериального перитонита у крыс путем санации брюшной полости монооксидом азота и оценка эффекта NO-терапии на уровни биохимических индикаторов в сыворотке крови и перитонеальном экссудате у крыс.
Материалы и методы исследования
Эксперименты выполнены на 22 белых лабораторных крысах-самцах линии Wistar, возраста 8–10 месяцев, массой 180–250 г, содержащихся в условиях стандартного вивария (согласно решению Совета Евразийской экономической комиссии № 79 от 03.11.2016 г. «Об утверждении Правил надлежащей клинической практики Евразийского экономического союза», приказа Министерства здравоохранения РФ № 199н от 01.04.2016 г. «Об утверждении Правил лабораторной практики», нормативно-правовых актов Российской Федерации в области биомедицинских исследований, Устава ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ Минздрава России и иных локальных нормативных актов ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ Минздрава России).
Перитонит у крыс моделировали внутрибрюшинным введением 1,0–1,5 мл взвеси E.coli в концентрации 1015. В данной модели развивающийся у крыс перитонит характеризуется быстро нарастающей интоксикацией, нарушением кишечной моторики, выраженными микроциркуляторными расстройствами.
Животных разделяли на 3 группы. Крысам I группа (сравнения), представленной 10 интактными животными, в первый день эксперимента однократно в брюшную полость инъекционным путем вводили стерильный физиологический раствор в количестве 2,0 мл. Крысам II и III группы эксперимента из 6 самцов каждая в первый день эксперимента моделировали перитонит однократным внутрибрюшинным введением взвеси 2×1015 микробных тел E.coli в 2 мл физиологического раствора.
Спустя 24 часа под эфирным наркозом 12 крысам II и III групп выполнены срединная лапаротомия и ревизия органов брюшной полости. Санация органов брюшной полости 6 крыс II групп ограничивалась промыванием брюшной полости стерильным физиологическим раствором и ушиванием раны кетгутовым швом. Санация брюшной полости 6 крыс III группы включала установку в отверстие в брюшной полости дренажной трубки, через наконечник которой с помощью аппарата «Плазон» подавался охлажденный NO-содержащий газовый поток. По завершении процедуры NO-терапии и промывания брюшной полости физиологическим раствором рана ушивалась наглухо.
В конце эксперимента в соответствии с приказом Минздрава РФ от 01.04.2016 г. № 199н «Об утверждении Правил лабораторной практики» (зарегистрирован в Минюсте России 15.08.2016 года № 43232), локальными нормативными актами ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ Минздрава России о «Порядок проведения эвтаназии (умерщвления животного)», выписками из протокола заседания локального этического комитета № 4 от 19.05.2022 г. все лабораторные животные умерщвлялись передозировкой эфирного наркоза.
Концентрации пептида лактоферрицина (ЛФЦ) в исследуемых образцах определяли на спектрофотометре «Becman DU–65» и выражали в е.о.п. / мл.
Содержание лизоцима (ЛЗЦ) в образцах сывороток и перитонеального экссудата определяли количественным колориметрическим микрометодом с тест-культурой убитых ацетоном бактерий Micrococcus Lysodecticus [12] и выражали в усл.ед / мл.
Исследование щелочной фосфатазы выполнено на автоматическом биохимическом анализаторе AU 5800 «Beckman Coulter, США». Для определения КЩФ одновременно с ЩФ во все образцы исследуемого биоматериала вносили специфический ингибитор L-гомоаргинин до концентрации 5 ммоль/л. Результаты определения ЩФ и КЩФ в сыворотках крови измеряли в Ед/л.
Титр антител к E.coli класса IgG крысы определяли с помощью перекрестно реагирующих реагентов, содержащих антитела к IgG человека, иммунохимическим методом Манчини (чувствительность метода 5 мкг/мл).
Полученные результаты обработаны статистически с помощью приложения Excel из пакета Microsoft Office. Проверка нормальности распределения, проведенная на основании оценки эксцесса и асимметрии, показала отсутствие нормального распределения в группах, в связи с чем результаты представлены в виде медианы, 25-го и 75-го квартилей и межквартильного размаха, а для проверки статистических различий в малых группах использовался непараметрический критерий U Вилкоксона–Манна–Уитни. Различия считались достоверными при р<0,05.
Результаты исследований и их обсуждение
У крыс I группы, получавших внутрибрюшинно стерильный физиологический раствор, при ревизии брюшной полости патологических процессов не отмечалось. У крыс II и III групп после введения инфекционного агента при ревизии брюшной полости обнаружены признаки разлитого гнойного перитонита.
Крысам III группы (NO-терапия), представленной 6 животными, на третьи сутки эксперимента на фоне разлитого гнойного перитонита проводили терапию экзогенным оксидом азота, подаваемым в брюшную полость в виде воздушно-плазменного потока (ВПП), генерируемого воздушно-плазменным аппаратом СКСВП/NO-01 «Плазон».
Для этого под наркозом крысу фиксировали к операционному столику. Пунктировали брюшную полость иглой в проекции белой линии живота и устанавливали в брюшную полость дренаж, который фиксировали двумя швами. После установки в отверстие дренажной трубки через металлический наконечник длиной 100 мм и диаметром выходного канала 0,7 мм в брюшную полость подавали охлажденный NO-содержащий газовый поток.
Для профилактики скопления высокой концентрации NO в определенных участках брюшной полости у фиксированного животного наконечник перемещали по брюшной полости массирующими движениями со скоростью луча 3 см в секунду. При этом размеры дренажной трубки обеспечивали зазор для выхода газа и профилактики избыточного давления в брюшной полости.
В контрольной группе I из десяти крыс манипуляции были представлены однократным введением физиологического раствора. Значения уровней антител к эшерихии коли, лактоферрицину, лизоциму и кишечному изоферменту щелочной фосфатазы в сыворотке крови и перитонеальном экссудате у 10 крыс контрольной группы I составили (таблица): 0,018 и 0,019 г/л для АТ к E.coli, 0,516 и 0,140 опт.ед/мл для ЛФЦ, 3,011 и 1,225 усл.ед/мл для ЛЗЦ и соответственно 11,87 и 1,810 уе/л для КЩФ. Причем, кроме АТ к E.coli, для трех остальных показателей их концентрации в перитонеальном экссудате были статистически достоверно ниже сывороточных уровней (p<0,05).
В группе II (перитонит) из шести крыс моделировали перитонит внутрибрюшинным введением взвеси E.coli в концентрации 2×1015 микробных тел, на третьи сутки выполняли срединную лапаротомию, проводили санацию органов брюшной полости с ушиванием операционной раны однорядным обвивным кетгутовым швом. После эвтаназии в крови и перитонеальном экссудате 6 крыс в группе II значения этих четырех индикаторов составили (таблица): 4,175 и 6,84 г/л для АТ к E.coli, 1,81 и 1,94 опт.ед/мл для ЛФЦ, 13,93 и 30,46 усл.ед/мл для ЛЗЦ и соответственно 62,32 и 74,70 уе/л для КЩФ. Все 8 показателей, представленных в таблице, статистически достоверно отличали группу II (перитонит) от контрольной группы I (таблица). Причем ни один из изученных показателей в группе II не позволил статистически достоверно отличить сывороточные уровни от их же уровней в перитонеальном экссудате.
В группе III (NO-терапия) из 6 крыс моделировали перитонит внутрибрюшинным введением взвеси E.coli в концентрации 2×1015 микробных тел, на третьи сутки выполняли срединную лапаротомию, проводили санацию органов брюшной полости с ушиванием операционной раны однорядным обвивным кетгутовым швом. На третьи сутки проводили NO-терапия аппаратом «Плазон», а после эвтаназии в крови и перитонеальном экссудате крыс оценивали значения четырех биохимических показателей. Значения этих индикаторов у 6 крыс в группе III составили (таблица): 3,30 и 1,98 г/л для АТ к E.coli, 0,91 и 0,51 опт.ед/мл для ЛФЦ, 10,86 и 13,05 усл.ед/мл для ЛЗЦ и соответственно 31,17 и 27,58 уе/л для КЩФ. Причем шесть показателей из восьми, представленных в таблице (АТ к E.coli, ЛЗЦ и КЩФ), статистически достоверно отличали группу III (NO-терапия перитонита) от контрольной группы I (таблица). Причем ни один из изученных показателей в группе III не позволял статистически достоверно отличить сывороточные уровни от их же уровней в перитонеальном экссудате.
Установлено, что у крыс с эшерихиозным перитонитом, леченным и не леченным NO-терапией, в сыворотках крови АТ к E.coli и ЛЗЦ отменяют явления перитонита только на 79 и 78% соответственно, а ЛФЦ и КЩФ – ровно в два раза, до 50%. Причем только КЩФ уменьшают явления перитонита на фоне NO-терапии статистически достоверно (р=0,037).
В перитонеальном экссудате у крыс с эшерихиозным перитонитом, леченным NO-терапией, угнетение показателей относительно изменений в перитонеальном экссудате у крыс II группы с перитонитом более существенно: 29% для АТ к E.coli, 26% для ЛФЦ, 43% для ЛЗЦ и 37% для КЩФ, причем для АТ к E.coli (р=0,007) и КЩФ (р=0,026) различия статистически достоверны (таблица). Отсутствие достоверных эффектов NO-терапии перитонита (отношение группы III к группе II) для ЛФЦ и ЛЗЦ при проведенных исследованиях на крысах объясняется небольшим объемом групп животных и диагностическими возможностями методов, использованных для определения ЛФЦ и ЛЗЦ в данной работе.
Результаты определения четырех биохимических показателей в сыворотке крови и перитонеальном экссудате у крыс с эшерихиозным перитонитом на фоне NO-терапии
|
Показатель |
Медиана (Ме) и размах между 25-м и 75-м квартилями |
||||
|
контроль |
Эшерихиозный перитонит |
NO-терапия перитонита |
|||
|
Группа I n=10 |
Группа II n=6 |
Группа III n=6 |
отношение групп III к II в % |
||
|
АТ к E.coli г/л |
Кровь |
0,018 [0,011; 0,031] |
4,175* [3,025; 6,338] р=0,0003 |
3,300* [2,420; 6,265] р=0,002 |
79% р=0,806 |
|
Экссудат |
0,019 [0,013; 0,029] |
6,840* [5,205; 8,663] р=0,0002 |
1,980* [1,250; 2,875] р=0,001 |
29%* р=0,007 |
|
|
ЛФЦ опт.ед/мл |
Кровь |
0,516 [0,395; 0,561] |
1,810* [1,110; 2,448] р=0,011 |
0,910 [0,491; 1,245] р=0,153 |
50% р=0,102 |
|
Экссудат |
0,140 [0,106; 0,193] |
1,940* [0,994; 2,765] р=0,003 |
0,510 [0,047; 1,800] р=0,141 |
26% р=0,411 |
|
|
ЛЗЦ усл.ед/мл |
Кровь |
3,011 [1,476; 5,386] |
13,930* [10,188; 18,004] р=0,004 |
10,860* [9,519; 15,528] р=0,003 |
78% р=0,683 |
|
Экссудат |
1,225 [1,084; 1,347] |
30,460* [17,411; 51,995] р=0,009 |
13,051* [7,419; 26,491] р=0,025 |
43% р=0,215 |
|
|
КЩФ уе/л |
Кровь |
11,868 [10,377; 13,637] |
62,317* [50,377; 78,248] р=0,003 |
31,165* [30,309; 43,803] р=0,006 |
50%* р=0,037 |
|
Экссудат |
1,810 [1,254; 2,256] |
74,700* [47,800; 95,605] р=0,0006 |
27,575* [18,438; 36,841] р=0,0005 |
37%* р=0,026 |
|
Примечание: * – статистически значимые различия с контролем.
Выводы
Установлено, что введение в брюшную полость крыс с эшерихиозным перитонитом монооксида азота с помощью аппарата «Плазон» за счет бактерицидного действия NO улучшает метаболизм в стенке кишки, о чем свидетельствуют результаты определения в крови крыс уровней четырех маркеров.
В сыворотке крови уровни антител к E.coli при эшерихиозном перитоните у крыс возрастают в 230 раз по сравнению с контрольными животными и только в 180 раз на фоне NO-терапии перитонита, а в перитонеальном экссудате – в 360 и 100 раз соответственно. На высокую диагностическую ценность определения антител к E.coli для оценки эффективности NO-терапии указывает статистически достоверное (р=0,007) снижение в перитонеальном экссудате отношения между группами III и II.
В сыворотке крови уровни лактоферрицина при эшерихиозном перитоните у крыс возрастают в 3,5 раза по сравнению с контрольными животными и только в 1,7 раза – на фоне NO-терапии перитонита, а в перитонеальном экссудате – в 13,9 и 3,6 раза соответственно. Несмотря на сильное понижение уровня ЛФЦ в перитонеальном экссудате под влиянием NO-терапии перитонита (до 26%), снижение отношения между группами III и II статистически незначимо (р=0,4).
В сыворотке крови уровни лизоцима при эшерихиозном перитоните у крыс возрастают в 4,6 раза по сравнению с контрольными животными и незначительно уменьшаются (до 3,6 раза) на фоне NO-терапии перитонита, а в перитонеальном экссудате содержание лизоцима изменяется в 25 и 10 раз соответственно. Несмотря на понижение уровня ЛЗЦ в перитонеальном экссудате под влиянием NO-терапии перитонита (до 43%), снижение отношения между группами III и II статистически незначимо (р=0,215).
В сыворотке крови уровни кишечной щелочной фосфатазы при эшерихиозном перитоните у крыс возрастают в 5,25 раза по сравнению с контрольными животными и в 2,63 раза на фоне NO-терапии перитонита, а в перитонеальном экссудате – в 41,3 и 15,2 раза соответственно. На высокую диагностическую ценность определения уровней КЩФ для оценки эффективности NO-терапии указывает статистически достоверное снижение отношения между группами III и II и в сыворотке (р=0,037), и в перитонеальном экссудате (р=0,026).
Четыре маркера с антибактериальным потенциалом, отобранные нами для изучения бактерицидного действия монооксида азота, могут стать перспективными диагностическими инструментами в экспериментальной и клинической абдоминальной хирургии.