Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

В настоящее время одним из самых привлекательных наноматериалов для контролируемого и локализованного высвобождения лекарственных и диагностических средств считается пористый кремний [1]. Такие его свойства, как высокая биосовместимость и биоразлагаемость до малотоксичной кремниевой кислоты, возможность настраивания необходимых размеров пор и обработки защитными покрытиями, способность к конъюгации с различными веществами, большая удельная поверхность, обеспечивающая их лекарственную нагрузку, а также наличие собственной фотолюминесценции, обусловили предпосылки для широкого использования наночастиц пористого кремния (НЧПК) в разных областях медицины, в частности в тераностике и фотодинамической терапии [2], иммунотерапии [3], генной терапии [4], в вакцинологии [5] и др. Утверждается, что наиболее подходящими являются наночастицы размерами свыше 50 нм, поскольку они могут избежать почечной фильтрации, что приводит к увеличению времени их циркуляции в кровотоке и, следовательно, позволяет более эффективно воздействовать на органы-мишени [6]. В то же время очевидно, что вводимые системно наночастицы разносятся кровью в различные органы и вызывают в них активацию мононуклеарной фагоцитарной системы, а значит, развитие непреднамеренной острой или хронической интоксикации. Учитывая бесспорные достоинства НЧПК и большие надежды, возлагаемые на них, необходимы глубокие исследования in vivo особенностей реакции различных органов на системное введение НЧПК разного размера, чтобы оценить потенциальные риски для здоровья и их надежность для клинической практики.

В связи с этим целью настоящего исследования является морфометрический анализ пула макрофагов в респираторном отделе крыс через 2 месяца после однократного внутривенного введения пористого кремния размерами 60–80 нм, 250–300 нм и 500–600 нм.

Материалы и методы исследования

Исследование проведено на 20 самцах крыс стока Wistar, соматически здоровых, массой 220–250 г (ФГУП «ПЛЖ «Рапполово», РАН, Россия), содержавшихся в стандартных условиях вивария конвенциональной категории. Объектом исследования явились НЧПК, полученные методом электрохимического анодного растворения кремния с последующей обработкой ультразвуком [7].

Животные были разделены на 4 группы: 1) контроль (n=5) – с введением физиологического раствора (К); 2) экспериментальная группа I (n=5) – с введением суспензии НЧПК размером 60–80 нм (ЭГI); 3) экспериментальная группа II (n=5) – с введением суспензии НЧПК размером 250–300 нм (ЭГII); 4) экспериментальная группа III (n=5) – с введением суспензии НЧПК размером 500–600 нм (ЭГIII). Суспензии НЧПК в концентрации 2 мг/мл вводили однократно в хвостовую вену в объеме 1 мл. Манипуляции с животными проводили в условиях анестезии препаратом Золетил (6 мг/кг), вводимым внутрибрюшинно. При экспериментальных исследованиях руководствовались приказом Минздрава России от 01.04.2016 г. № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики» и рекомендациями Этического комитета ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России. Забор материала осуществляли через 2 месяца после введения НЧПК. Для получения сопоставимых результатов образцы обрабатывали параллельно и в одинаковых условиях. Получали фронтальный срез доли левого легкого, растянутого при фиксации 10%-ным формалином (рН 7,4). Для гистологического анализа использовали парафиновые срезы толщиной 5 мкм, изготовленные с помощью микротома Accu-Cut SRT 200 (Sakura, Япония), окрашенные гематоксилином и эозином и по методу Маллори («Биовитрум», Россия). Содержание соединительной ткани в респираторном отделе легкого оценивали визуально.

Макрофаги выявляли при помощи первичных моноклональных мышиных антител Anti-CD68 antibody (ab 31630) (Abcam) при разведении 1:1000 и инкубации в течение 60 мин при комнатной температуре. Для выявления связавшихся первичных антител использовали мультимерную безбиотиновую систему (D&A, Reveal-Biotin-Free Polyvalent DAB, Spring Bioscience Corporation, USA). Подсчет альвеолярных и интерстициальных макрофагов (аМФ и иМФ соответственно) производили на цифровых изображениях срезов респираторного отдела легкого, полученных при помощи светового микроскопа Leica DM750 (Leica, Германия) и цифровой фотокамеры ICC50 (Leica, Германия), с помощью прикладной компьютерной программы анализа изображений ImageScope Color (версия M). Для каждого животного на срезе подсчитывали число CD68+ клеток в интерстиции легкого и в альвеолах в 20 полях зрения, площадью 0,33х0,25 мм каждое поле, при объективе х10, окуляре х40.

Статистический анализ проводили при помощи программы IBM SPSS Statistica 23 c использованием критерия Колмогорова–Смирнова и непараметрического U-критерия Манна–Уитни при p<0,05. Результаты представлены в виде медианы данных из каждой выборки и среднего расстояния от медианы до 25/75 квартиля.

Результаты исследования и их обсуждение

Во всех экспериментальных группах макроскопическая картина легких без патологических изменений и соответствует контрольным значениям. Микроскопически архитектоника бронхов и респираторного отдела сохранена.

В ЭГI число иМФ и аМФ незначимо возрастает по сравнению с показателями в группе К, размеры макрофагов визуально не увеличены. В просвете альвеол содержимого нет, в интерстиции иМФ лежат преимущественно поодиночке, определяется незначительное число лимфоцитов, толщина интерстиция и содержание соединительной ткани визуально не изменены.

В ЭГII и ЭГIII в альвеолах визуализируются одиночные аМФ, их число соответствует контрольным значениям, размеры не увеличены. В интерстиции иМФ лежат преимущественно поодиночке, но определяются редкие очаговые скопления (2–3 иМФ), визуально толщина межальвеолярной перегородки не изменена и содержание соединительной ткани не увеличено. Число иМФ возрастает в ЭГII до 160% по сравнению с контрольным значением: 8±3 клеток в поле зрения против 5±4 (p=0,001), и до 220% в ЭГIII: 11±6 клеток в поле зрения против 5±4 (p=0,001). Также в ЭГII и ЭГIII визуализируется увеличение размеров иМФ по сравнению с группой К и ЭГI. При этом на всем сроке эксперимента не наблюдается увеличения клеточного пула тучных клеток, лимфоцитов, нейтрофилов, эозинофилов.

Настоящее исследование показало, что через 2 месяца число иМФ увеличивается во всех экспериментальных группах, а в ЭГII и ЭГIII увеличивается значимо.

Макрофагальная реакция в интерстиции респираторного отдела легкого свидетельствует, вероятно, о том, что НЧПК использованных в настоящем исследовании размеров не подвергаются почечной фильтрации и задерживаются в организме, в нашем случае в легких, на неопределенный срок, что подтверждают имеющиеся в литературе сведения [6].

Респираторный отдел легкого контрольного животного (a) и с введением суспензии НЧПК размером 500–600 нм (б). Звездочка – альвеолярный макрофаг, стрелка – интерстициальный макрофаг. Иммуногистохимическое выявление CD68+ клеток с подкраской срезов гематоксилином. Ок.10, об.40

Динамика показателей объектов морфометрии в респираторном отделе легкого после введения наночастиц пористого кремния различного размера

а – показатели статистически значимо отличаются от группы контроля при р<0,05.

Не менее интересен факт явного увеличения размеров иМФ в экспериментах с введением частиц 250–300 нм и 500–600 нм. Данное явление связано, скорее всего, с различиями в скорости биодеградации НЧПК: внутриклеточная концентрация частиц размером 60–80 нм за 2 месяца эксперимента понижается быстрее, чем концентрация частиц, размеры которых приближаются к микрометровой величине.

Ранее авторы показали, что НЧПК исследуемых размеров интернализируются в печени различными механизмами. Элиминационная функция клеток Купфера ярко проявляется при введении частиц размерами 250–300 нм и 500–600 нм, что приводит к формированию многочисленных мелких гранулем в печени [8]. В настоящем исследовании значимое увеличение иМФ в интерстиции легкого также вызывается НЧПК данных размеров. Образование крупных и немногочисленных гранулем в печени при введении НЧПК размером 60–80 нм авторы связывали с интернализацией по механизму диффузии [8, 9]. Очевидно, по такому же механизму осуществляется интернализация этих частиц и в интерстиции легкого, что косвенно подтверждается незначительным повышением числа аМФ в ЭГI. Возможно, часть НЧПК размером 60–80 нм при длительной циркуляции в организме все-таки диффундируют через аэрогематический барьер. В то же время ни в ЭГII, ни в ЭГIII не происходит увеличения числа аМФ, что, как предполагается авторами, свидетельствует о невозможности частиц таких размеров проникать через аэрогематический барьер.

В предыдущих работах с введением наночастиц диоксида кремния размерами 7, 12 и 34 нм было показано, что в интерстиции легкого развивается асептическое воспаление, представленное только пролиферирующими иМФ, без участия тучных клеток, лимфоцитов, нейтрофилов, эозинофилов. При этом разрастания соединительной ткани даже на поздних сроках эксперимента авторы не обнаружили [10, 11]. Схожая картина наблюдается и в настоящем исследовании: асептическое воспаление в интерстиции легкого развивается только за счет увеличения числа иМФ. Соединительнотканного ремоделирования паренхимы легкого не происходит ни в одной экспериментальной группе.

Заключение

Однократное внутривенное введение НЧПК микрометровой величины 250–300 нм и 500–600 нм вызывает в интерстиции респираторного отдела легкого асептическое воспаление без признаков соединительнотканного ремоделирования. Введение НЧПК размером 60–80 нм не приводит к значимым изменениям в пуле как иМФ, так и аМФ. Полученные данные свидетельствуют о необходимости учитывать размер частицы-носителя при выборе систем направленной лекарственной доставки.

Принятые сокращения: НЧПК – наночастицы пористого кремния, аМФ – альвеолярные макрофаги, иМФ – интерстициальные макрофаги.