Введение
Из трех европейских видов рододендронов, произрастающих на территории Российской Федерации [1–3], менее изученным является рододендрон кавказский (Rhododendron caucasicum Pall.), причем это можно отнести и к вопросам о составе его биологически активных соединений (БАС), и к его ботанической характеристике.
Это растение является эндемиком флоры Северного Кавказа РФ [4–6] и интересно тем, что его отвары и настойки с давних пор применяются в народной медицине для лечения ревматизма, бронхитов, инфекционных заболеваний, головных болей, а также как общеукрепляющее и тонизирующее средство [6–8]. Все вышеописанные эффекты рододендрона кавказского связаны с его вторичными метаболитами. Наиболее изученными видами сырья этого производящего растения являются листья, в меньшей мере изучены цветки и побеги [9–11]. Следует подчеркнуть, что изучение состава БАС плодов рододендрона кавказского и описание их диагностических признаков до настоящего времени не проводились.
Цель исследования – изучение диагностических признаков и состава полифенольных соединений плодов рододендрона кавказского.
Материалы и методы исследования
В работе использовали сырье – плоды рододендрона кавказского (Rhododendron caucasicum Pall.), заготовленные в августе 2022 г. и августе 2023 г. и высушенные воздушно-теневым способом. Определение влажности сырья проводили по методике ГФ XV [12].
Макроскопический анализ. Для определения макроскопических признаков использовали свежесобранное и высушенное сырье, описание признаков проводили по технике макроскопического анализа согласно ГФ XV [12].
Микроскопическое исследование. Для микроскопического изучения образцов сырья готовили микропрепараты плодов и семян с поверхности и поперечными срезами, адаптируя методики, описанные в ГФ XV [12]. Сырье предварительно кипятили в 3 % растворе натрия гидроксида, а также замачивали на трое суток в спирто-водно-глицериновой смеси (1:1:1). Микропрепараты просматривали с помощью микроскопа «МИКРОМЕД-1» с тринокулярной насадкой, с объективами 4×, 10×, 40×, 100×, окулярами 10×. Регистрировали результаты с помощью камеры для микросъемок Digital Camera for Microscope DCIM 1.3 Mpixes.
Методика получения экстракта плодов рододендрона кавказского. С целью сохранения системности в изучении сырья рододендрона кавказского, авторами были получены экстракты по аналогии с листьями и цветками этого производящего растения [13] по следующей методике: около 5,0 г (точная навеска) измельченных и просеянных через сито с диаметром отверстий 1 мм плодов рододендрона кавказского помещали в круглодонную колбу со шлифом объемом 250 мл, прибавляли 50 мл спирта этилового 95 % и экстрагировали в течение 2 ч с обратным холодильником при температуре 80 °С. По истечении 2 ч нагревание прекращали, порцию экстракта остужали до комнатной температуры и фильтровали в склянку из темного стекла через бумажный фильтр. Затем к навеске сырья добавляли вторую порцию экстрагента – 50 мл спирта этилового 95 % и полностью повторяли процедуру экстракции. После экстракции первую и вторую порции экстракта объединяли [13].
Анализ методом спектрофотометрии в видимой и УФ областях. Экстракт плодов рододендрона кавказского в количестве 0,5 мл переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводили объем до метки спиртом этиловым 95 %. 1 мл полученного раствора переносили в мерную колбу вместимостью 5 мл и доводили объем раствора до метки тем же растворителем. Регистрацию УФ-спектров поглощения проводили в соответствии с требованиями, приведенными в ГФ XV [12], на спектрофотометре УФ-Виз в кюветах с толщиной слоя 1 см в интервале длин волн от 190 до 450 нм, в качестве раствора сравнения использовали спирт этиловый 95 %.
Анализ методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). На линию старта предварительно активированных в сушильном шкафу хроматографических пластинок марки «Sorbfil ПТСХ-АФ-В-УФ» размером 100×150 мм наносили 10 мкл испытуемого экстракта и по 2 мкл растворов стандартных образцов (СО). Пластинки помещали в предварительно насыщенные парами подвижной фазы (ПФ) хроматографические камеры, хроматографировали при комнатной температуре восходящим способом. Когда фронт ПФ проходил около 90 % длины пластинки от линии старта, пластинку вынимали, сушили на воздухе до улетучивания паров ПФ и просматривали в видимом свете и УФ-свете при длинах волн 254 нм и 365 нм. Для визуализации дитерпеноидов, в частности грайанотоксинов (GTX), пластинки обрабатывали реактивом Година [8].
Ранее авторами изучались листья и цветки рододендрона кавказского метом ТСХ [13], поэтому при анализе его плодов в эксперименте использовали те же ПФ: А – этилацетат; Б – этилацетат – ацетон (1:2); В – бензол – метанол – уксусная кислота (8:6:1); Г – н-бутанол – уксусная кислота – вода (4:1:5); Д – хлороформ – метанол – вода (7:3:1).
Приготовление растворов стандартных образцов (СО). Точную навеску 0,0100 г СО или хлорогеновой кислоты (CAS 327-7-9, Sigma), или галловой кислоты (CAS 5995-86-8 Sigma), или коричной кислоты (CAS 140-10-3 Sigma), или умбеллиферона (CAS 93-35-6 Sigma), или лютеолина (CAS 491-70-3, Фитопанацея), или рутина (CAS 153-18-4 Фитопанацея), или кверцетина (CAS 117-39-5 Фитопанацея) помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяли в спирте этиловом 95 % и доводили объем раствора до метки тем же растворителем.
Результаты исследования и их обсуждение
На первом этапе исследования были изучены морфолого-анатомические признаки плодов рододендрона кавказского. Следует отметить, что до настоящего исследования данные, характеризующие морфолого-анатомические признаки плодов рододендрона кавказского, не публиковались.
В монографиях J. Cullen [4], А.И. Галушко [2], в автореферате М.Е. Жаворонковой [5] сведения об анатомических признаках плодов рододендрона кавказского также отсутствуют. В ходе исследования установлено, что плод рододендрона кавказского – это желто-бурая ценокарпная коробочка, вскрывающаяся продольно. Эндокарпий склерефицирован; плодолистиков, участвующих в образовании коробочки, 5. Таким образом, плод разделен на 5 гнезд с каменистым эндокарпием. Внутри каждого гнезда множество мелких (длиной около 0,5–1 мм) светло-желтых семян.
Далее были изучены микродиагностические признаки плодов рододендрона кавказского. На поперечном срезе хорошо видны экзокарпий, мезокарпий и эндокарпий (рис. 1). Экзокарпий представлен округлыми клетками, по всей поверхности видны простые многоклеточные, перегнутые в нескольких местах волоски (рис. 2, а, б, и 3, а, б). Паренхима мезокарпия состоит из клеток овальной и слегка многоугольной формы (рис. 2, в, и 3, в). В эндокарпии хорошо заметны склеренхимные волокна – довольно длинные клетки с многослойными толстыми оболочками (рис. 2, в, и 3, в).
Рис. 1. Поперечный срез плодов рододендрона кавказского (ув. ×100) (фото авторов)
Рис. 2. Поперечный срез плодов рододендрона кавказского (ув. ×200): а – клетки экзокарпия с волосками; б – волоски на поверхности плода; в – клетки мезокарпия и эндокарпия (фото авторов)
Рис. 3. Поперечный срез плодов рододендрона кавказского (ув. ×400): а, б – клетки экзокарпия с волосками; в – клетки мезокарпия и эндокарпия (фото авторов)
Рис. 4. Строение семян рододендрона кавказского (фото авторов)
Рис. 5. Спектр поглощения экстракта плодов рододендрона кавказского
Семена рододендрона кавказского светло-желтого цвета очень мелкие, в длину от 0,5 до 1 мм, поэтому препарировать их не представлялось возможным. Семена рассматривали под микроскопом в целом виде (рис. 4).
При микроскопическом исследовании семян рододендрона кавказского установлено, что они вытянутой формы; с одного края имеются одноклеточные волоски, с противоположной стороны – только клетки эпидермиса (рис. 4). Таким образом, впервые изучены микроскопические признаки экзокарпия, мезокарпия и эндокарпия плодов рододендрона кавказского.
На следующем этапе исследования было определено значение влажности плодов рододендрона кавказского, так как этот показатель качества растительного сырья является обязательным, учитывается при расчете содержания БАС и оказывает влияние на сохранность сырья [12]. Установлено, что среднее значение влажности плодов рододендрона кавказского составило 13,86 % и 13,89 % для серий сырья 2022 и 2023 гг. соответственно.
По аналогии с изучением листьев и цветков этого растения [13] в качестве предварительного метода исследования химического состава плодов рододендрона кавказского применяли метод спектрофотометрии. Электронный спектр поглощения экстракта плодов рододендрона кавказского имеет выраженные максимумы при 205, 280 и 329 нм. Максимум при 650 нм имел значение оптической плотности на уровне шума (рис. 5) [13].
Для анализа профиля полученного спектра сравнили его максимумы поглощения с таковыми на УФ-спектрах растворов имеющихся СО полифенолов в спирте этиловом 95 %. Так, на спектре раствора СО галловой кислоты установлены максимумы поглощения при 214 нм и 264 нм, коричной кислоты – 270 нм, хлорогеновой кислоты – 329 нм. Производное кумарина – умбеллиферон характеризовался максимумами при 203 нм и 326 нм. УФ-спектры агликонов флавоноидов имели максимумы светопоглощения для лютеолина – при 256 нм, 353 нм; кверцетина – при 256 нм, 374 нм. Для раствора СО флавоноида гликозида – рутина зафиксированы максимумы при 258 нм и 359 нм [13].
Очевидно, что при анализе экстракта плодов рододендрона кавказского речь идет о суммарном извлечении, содержащем несколько классов БАС, а на спектре происходит наложение нескольких полос поглощения, специфичных для различных групп БАС. Однако положение максимумов позволяет предварительно предположить, что экстракт содержит ароматические соединения, в частности полифенолы.
Далее экстракт плодов рододендрона кавказского проанализировали более специфичным методом ТСХ. Согласно литературным данным ПФ А, Б, В, Д используют для идентификации и дитерпеноидов, и полифенолов [10, 11]. ПФ Г – н-бутанол – уксусная кислота – вода (4:1:5) является смесью растворителей, наиболее часто и широко используемой для разделения веществ флавоноидной природы. Идентификацию полифенолов проводили в сравнении с СО, определяя факторы удерживания для зон адсорбции на треках экстракта (Rf), факторы удерживания для зон адсорбции на треках растворов СО.
Поскольку зоны адсорбции дитерпеноидов грайанового типа не визуализируются в дневном свете и облучением ультрафиолетом при 365 и 254 нм, для проявления их зон адсорбции после идентификации полифенолов хроматограммы обрабатывали реактивом Година, при этом дитерпеноиды проявлялись в виде сине-фиолетовых зон адсорбции.
Эксперимент по определению полифенольных соединений показал следующие результаты: ПФ А позволила разделить пять соединений, при этом идентифицирован один флавоноид – кверцетин и дополнительно установлено наличие четырех неидентифицированных полифенолов; ПФ Б выявила семь полифенолов, из них достоверно идентифицированы галловая и коричная кислоты, рутин, кверцетин, лютеолин, умбеллиферон; с помощью ПФ В было обнаружено пять соединений, из которых идентифицированы галловая кислота, рутин и умбеллиферон; ПФ Г показала наличие шести полифенолов, а идентифицированы галловая кислота, лютеолин, рутин, кверцетин и умбеллиферон; ПФ Д подтвердила присутствие пяти полифенольных соединений, с идентификацией галловой кислоты, лютеолина и умбеллиферона.
После обработки хроматограмм реактивом Година предварительно в плодах рододендрона кавказского обнаружены неидентифицированные дитерпеновые производные: в ПФ А – три соединения, в ПФ Б, В, Д – по два вещества, в ПФ Г – одно соединение.
Выводы
1. Установленное значение влажности для сырья в дальнейшем можно использовать как базовое для установления норм качества плодов рододендрона кавказского.
2. Объединяя результаты анализа с применением всех пяти подвижных фаз, можно констатировать, что плоды рододендрона кавказского содержат кислоты – галловую, хлорогеновую и коричную, флавоноиды – рутин, кверцетин, лютеолин и производное кумарина – умбеллиферон.
3. Предварительный результат, полученный методом ТСХ, позволяет предположить, что в плодах присутствуют производные дитерпеноидов.