Введение
Широко применяемый в практике антиокислитель ионол (2,6-ди-треть-бутил-п-крезол, бутилированный окситолуол, алкофен-БП, бубинол) считается малотоксичным ингибитором окислительных процессов, применяется в качестве консерванта в производстве пищевых продуктов, смазочных масел, каучуков, пластмасс и др. [1]. Поступление в организм малых доз ионола с пищей может иметь положительный эффект благодаря возможности нейтрализовывать свободные радикалы и прерывать цепные реакции с участием свободных радикалов. Системы свободнорадикального окисления и антиоксидантов в нормальных условиях течения физиологических процессов сбалансированы. Негативные отклонения той или другой системы в сторону усиления или ослабления наблюдаются в патологических процессах. Одинаково отрицательно сказывается как усиление свободнорадикального окисления, так и высокая активность антиоксидантной системы. Поэтому эти процессы принимаются во внимание при изучении различных патологических процессов.
В реализации неспецифической резистентности организма широким планом выступает фагоцитоз. В фазе переваривания вслед за погружением фагосомы усиливаются окислительные процессы, при которых определенную роль играют внутриклеточная глюкоза и фермент миелопероксидаза, отражая при этом усиление активности свободных радикалов.
Физиологическая и патологическая регенерация в процессе обновления тканей включает и процесс апоптоза клеток. С потерей клеток функциональной способности начинается процесс деструкции. Клетка приобретает свойства антигена и становится объектом фагоцитоза. Следовательно, уровень активности внутриклеточных фермента миелопероксидазы и гликогена в условиях повышения количества кислородных радикалов может отражать и динамику апоптоза. В процессе патологического обновления тканей, естественно, играет важную роль и антиоксидантная система ткани. Это обстоятельство учитывается в процессе лечебно-профилактических мероприятий. Во многих нозологических формах патологии преобладает апоптоз с усилением активности фермента миелопероксидазы и содержания внутриклеточного гликогена. В таких случаях широко применяются антиоксиданты. При этом возникает проблема, связанная с передозировкой антиоксиданта.
Вполне определенное значение в настоящее время приобретают исследования, связанные с ролью свободных радикалов кислорода в динамике масштабов апоптоза. Повышение активных форм кислорода отмечено при усилении апоптоза во многих патологических состояниях: сахарный диабет, гибель макрофагов, фибробластов, гладких миоцитов в области атеробластических бляшек, Т-клеток хелперов при СПИДе, синовиальных клеток при ревматоидном артрите, нервных клеток при нейродегенеративных заболеваниях. Есть также сведения, что гипоксия снижает апоптоз тимоцитов, обусловленный повышением содержания глюкокортикоидов [2, 3].
Целью в данном исследовании явилось установление изменения направленности действия антиоксидантов на показатели крови с повышением их концентрации в организме.
Материалы и методы исследования
В качестве материала исследования были использованы взрослые самцы кроликов породы шиншилла в возрасте 1–3 года. Животным вводили раствор ионола внутримышечно ежедневно в продолжение 10 дней в дозе равной 200 мг/кг. Показатели форменных элементов крови определялись с помощью гематологического анализатора. Цветовой показатель (ЦП) равнялся: гемоглобин (г/л) х3 / три первые цифры количества эритроцитов. Окраска мазков крови производилась краской азур-эозином. Цитохимические исследования фермента миелопероксидазы в нейтрофилах производились с использования окраски мазков крови по методу Грэхема – Кнолля [3, 4].
Средний цитохимический коэффициент (СЦК) определяли в процентах по формуле:
СЦК = (Ах3+Вх2+Сх1+Дх0) / 100,
где А – % клеток с интенсивным окрашиванием; В – % клеток с умеренным окрашиванием, С – % клеток со слабым окрашиванием, Д – % клеток при отсутствии окрашивания.
Перекисное окисление липидов (ПОЛ) эритроцитарной массы исследовалось с помощью биохемилюминометра БХЛ-06 с фотоэлектронным умножителем ФЭ 000.335.557.
Цифровые результаты работы были проанализированы методами математической статистики. Для определения достоверности различий использовали непараметрический критерий Вилкоксона для сопряженных распределений пар. При этом одно и то же животное является контролем (исходное состояние) и экспериментальным (в процессе опыта) [5, с. 34, 35]. Вычисление проводится по формуле: S = Σd2 – Σd/n; Sd = √ S / (п-1); td = d/ Sd. (h – 0,2. S = 0,04-0,2 = 0,16. Sd = √0.16 = 0,4/9 = 0,044. td = 0,2/0,044 = 4,48. 4,48 > 2.3). d – разность между средними показателями (М) исходного состояния эксперимента. Если td> tst, то при P = 0,05 (по таблице), разница получается достоверно [5].
Опыты проводились с соблюдением основных принципов биоэтики, морально-этических принципов проведения биомедицинских экспериментов на животных, сформулированных локальным этическим комитетом БГМУ (председатель проф. А.Г. Хасанов).
Сводные показатели крови кроликов при введении ионола 200 мг/кг (М ± m; п-10; *– Р < 0,05 в сравнении с исходным уровнем)
|
Показатели |
Исходный уровень |
Через 4 сут |
Через 6 сут |
Через 8 сут |
Через 10 сут |
|
Количество эритроцитов (х1012/л/л) |
4,66±0,155 |
4,23±0,143 |
4,11±0,165 |
3,89±0,133 |
3,61±0,135 |
|
Содержание гемоглобина (г/л) Средняя концентрация корпускулярного гемоглобина (MCHC) (г/л) |
141,60±4,982 321,12±10,358 |
139,86±4,796 304,91±11,147 |
138,31±4,881 289,11±9,318 |
137,65±4,812 273,41±9,328 |
134,66±4,682 253,21±8,958 |
|
Цветовой показатель |
0,911±0,031 |
0,992±0,033 |
1.009±0,029 |
1,061±0,042 |
1,080±0,041 |
|
Дегенеративные эритроциты (%) |
0,73±0,031 |
1,13±0,033 |
1,44±0,035 |
1,87±0,034 |
2,12±0,037 |
|
ПОЛ эритроцитов (S-60 с.. имп.х102) |
23,2±0,873 |
25,2±0,867 |
31,6 ±0,965 |
35,0±0,975 |
39,3±1,211 |
|
Количество лейкоцитов ((х109/л/л)) |
6,45±0,215 |
7,12±0,255 |
7,56±0,297 |
8,61±0,311 |
9,71±0,363 |
|
Нейтрофилы юные (%) |
0 |
0 |
0,76±0,025 |
1,13±0,029 |
1,52±0,036 |
|
Нейтрофилы палочкоядерные (%) |
3,11±0,107 |
3,89±0,011 |
4,57±0,019 |
5,71±0,021 |
6,55±0,028 |
|
Нейтрофилы сегментоядерные (%) |
29,12±0,939 |
31,54±1,13 |
32,71±1,165 |
34,32±1,189 |
36,92±1,198 |
|
Деструктивные лейкоциты (%) |
0.91±0,031 |
1,21±0,039 |
1,46±0,041 |
1,89±0,056 |
2,11±0,061 |
|
Моноциты (%) |
3,47±0,119 |
4,12±0,123 |
4,68±0,141 |
5,11±0,155 |
5,33±0,159 |
|
СЦК миелопероксидазы (усл. ед.) |
2,81±0,093 |
3,18 ±0,121 |
3,22±0,145 |
3,29±0,152 |
3,36±0,161 |
Примечание: М – среднее арифметическое значение, m – среднее квадратическое отклонение, N – число подопытных животных. * Р < 0,05 – признак статистической значимости.
Результаты исследования и их обсуждение
В данной работе было предпринято изучение влияния антиоксиданта ионола на состояние крови при высокой ее концентрации на уровне 200 мг/кг. Задачей стало установление возможного изменения направления его действия на окислительный процесс в связи с повышением его содержания в крови. Поэтому проводилось исследование состояния некоторых параметров красной крови и лейкоцитарной реакции (таблица).
Изучение изменений общего количества эритроцитов и процентного содержания ее дегенеративных форм, а также гемоглобина дало возможность установить некоторые особенности процесса регенерации. Так, количество эритроцитов в конкретном объеме крови по мере продолжения действия ионола имело тенденцию к снижению и через 10 суток начала опыта в среднем составляло 77,46 % от исходного уровня. Относительное число дегенеративных эритроцитов повысилось и через 10 суток равнялось 290,41 %. Одновременно снижалось содержание гемоглобина и через 10 суток оказалось на уровне 95,1 %, то есть значительно в меньшей степени, чем уменьшение количества эритроцитов. Это отражалось в повышении значения ЦП. Через 10 суток действия ионола этот параметр равнялся 118,68 % от исходного уровня. Повышение значения ЦП согласуется со сдвигом сводного значения средней концентрации корпускулярного гемоглобина (МСНС). Через 10 суток опыта величина МСНС равнялась 78,8 % от исходного состояния. Следовательно, под действием относительно высокой концентрации ионола (200 мг/кг) наступила гиперхромная анемия. Чтобы выяснить причины эритропении, было предпринято изучение красной крови методом хемилюминесценции. При этом было установлено, что светосумма (S-60 с. имп.х102) ПОЛ эритроцитов изменилась и через 10 суток действия ионола оказалась на 169,4 % выше исходного уровня. Итак, в процессе действия ионола имело место доминирование процесса эриродиэреза над эритропоэзом. Повышение значения цветового показателя во время опыта, очевидно, является результатом усиления гемолиза эритроцитов вследствие повышения активности свободных радикалов кислорода и подавления темпов окислительного фосфорилирования. Следовательно, тканевая и гемическая гипоксия вместе уже представляют смешанную форму гипоксии. Итак, возможно наступил порочный круг, тканевая гипоксия усиливает гемическую гипоксию, в свою очередь, анемия обуславливает присоединение анаэробного окисления с уменьшенной формой синтеза АТФ. Снижение окислительного фосфорилирования повышает темпы апоптоза и некроза структур, ответственных за кислородное обеспечение. Усиление апоптоза и некроза этих структурных образований в целом усугубляет кислородное голодание. Таким образом, порочный круг замыкается в масштабе всего организма.
Кислородная недостаточность в организме, естественно, сопровождается изменением лейкоцитарной реакции. Чтобы установить возможный сдвиг со стороны белой крови, было предпринято изучение количества лейкоцитов в конкретном объеме циркулирующей крови и состояние нейтрофилов, моноцитов и деструктивных лейкоцитов (таблица). Было установлено, что по мере повышения концентрации ионола в крови количество лейкоцитов увеличивалось с максимальным выражением на 10 сутки эксперимента и составило 144,7 % по сравнению с исходным уровнем. Изменения произошли и в лейкоцитарной формуле. Юные формы нейтрофилов в периферической крови в первые 5 суток отсутствовали, появились через 6 суток, а через 10 суток среднее число их увеличивалось на 200 %. Повышение содержания палочкоядерных нейтрофилов по сравнению с исходным уровнем через 10 суток составило 210,61 %. Увеличение процентного содержания сегментоядерных нейтрофилов происходило в меньшей степени, через 10 суток в среднем составило 126,78 % от исходного уровня. Количество моноцитов и деструктивных лейкоцитов также повышалось, и через 10 суток опыта разница с исходным состоянием в среднем составляла соответственно 153,6 % и 231,86 %.
Одновременно изучалось состояние активности миелопероксидазы нейтрофилов в условиях действия на организм относительно высокой дозы ионола. По мере увеличения сроков введения препарата было отмечено повышение значения данного показателя и через 10 суток СЦК составлял 119,57 % от исходного уровня.
Итак, введение ионола в дозе 200 мг/кг ежедневно в течение 10 суток, когда наступил определенный уровень кислородного голодания организма, повысилась активность белой крови, в частности был отмечен нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом влево и с повышением активности миелопероксидазы, а также моноцитоз. Одновременно происходило и усиление деструкции лейкоцитов. Увеличение количества деструктивных лейкоцитов, естественно, является отражением сдвига процессов обновления, регенерации в виде усиления апоптоза клеток в белой крови и сокращения сроков функционирования.
Со снижением, далее потерей клеток функциональной способности начинается и процесс деструкции. Клетка приобретает свойства антигена и становится объектом фагоцитоза. Следовательно, состояние внутриклеточных миелопероксидазы и гликогена при повышении активности кислородных радикалов может показать динамику апоптоза. В процессе патологического обновления тканей, естественно, играет важную роль и антиоксидантная система ткани. Это обстоятельство учитывается и при лечебно-профилактических мероприятиях. Следовательно, важно сохранить оптимальное взаимодействие между системой свободнорадикального окисления и антиоксидантами. С одной стороны, апоптоз клеток и усиление фагоцитоза в этом процессе являются катаболическими процессами, с другой – это обязательный компонент тканевого обновления, одновременно стимулирующий пластический процесс, анаболизм. Во многих нозологических формах патологии преобладает апоптоз с усилением активности фермента миелопероксидазы и содержания внутриклеточного гликогена. В таких случаях широко применяются антиоксиданты. При этом возникает вопрос о передозировке антиоксиданта и учет уровня активности фермента миелопеоксидазы и внутриклеточного содержания гликогена в нейтрофилах крови. Усиление апоптоза клеток, естественно, сопровождается повышением процесса элиминации разрушенных структур, которое реализуется в том числе фагоцитозом макрофагами и нейтрофилами.
Фагоцитоз сопровождается «окислительным взрывом», в процессе которого усиливается окисление глюкозы и в десятки раз повышается потребление кислорода. В динамике этого процесса используется перекись водорода, который распадается с образованием гидроксильного водорода (НО), самого агрессивного из активных форм кислорода против антигенного действия. Этот процесс катализируется содержащейся в фагоцитирующих клетках миелопероксидазой. Одновременно представляет интерес тот факт, что в случае незавершенного фагоцитоза, который характерен сохранением активности фагосомы, образование активных форм кислорода продолжается. Этот процесс может привести к деструкции самого фагоцита и окружающей ткани. Следовательно, гемическая гипоксия, наблюдаемая при действии относительно высоких доз ионола, является результатом усиления процесса апоптоза в красной крови с последующим высоким уровнем фагоцитоза, в том числе со стороны лейкоцитов. Исходя из этого следует полагать, что ионол в дозе равной 200 мг/кг проявляет проокислительное действие, способствует повышению ПОЛ клеточных мембран, доминированию свободнорадикального окисления над окислительным фосфорилированием, обусловливая анемическое состояние.
Выводы
1. Действие относительно высокой концентрации ионола на уровне 200 мг/кг ежедневно в течение 10 дней обусловливало появление признаков гиперхромной анемии. Причиной последней, вероятно, явилось доминирование свободнорадикального окисления над окислительным фосфорилированием с последующим развитием смешанной гипоксии, в том числе в системе крови. Такое состояние вполне согласуется с усилением при этом ПОЛ эритроцитов. Ускорение апоптоза в системе красной крови также явилось результатом аварийного функционирования эритроцитов с высоким износом структур в условиях гемической гипоксии. Данное состояние отражалось и в повышении значения ЦП и увеличении процентного содержания дегенеративных форм эритроцитов в процессе опыта.
2. Параметры белой крови указывали на ускорение процессов катаболизма и одновременно на ответное усиление адаптивной реакции в условиях действия относительно высокой концентрации (200 мг/кг) ионола в течение 10 дней. Повышение апоптозного процесса при этом отражалось, в частности, увеличением среднего содержания в лейкограмме деструктивных лейкоцитов. Увеличение количества лейкоцитов, в том числе нейтрофилез со сдвигом влево и моноцитоз, а также увеличение значения СЦК миелопероксидазы, очевидно, связаны с расширением масштабов фагоцитоза при ускорении апоптоза в условиях прооксидантного действия ионола в данной высокой концентрации.