Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,556

Введение

Увеличение площадей засоленных почв представляют собой серьезную угрозу сельскому хозяйству. Засоление почв связано с несколькими причинами, одной из которых является изменение климата – повышение общей температуры воздуха приводит к увеличению испарения воды из почвы и тем самым повышает ее засоленность [1]. Другой причиной является уменьшение доступности пресной воды и использование минерализованных вод для полива. В настоящее время масштабы засоления почв продолжают возрастать. По оценке ФАО (Food and Agriculture Organization of the United Nations) к 2050 г. из-за засоления потеря пахотных земель во всем мире составит 50 % [2]. При засолении происходит ухудшение структурного состава почвы, уменьшается накопление гумуса, что приводит к снижению плодородия и биоразнообразия почвенной микрофлоры. Также засоление является серьезным абиотическим стрессом, который губительно воздействует на растения. Все перечисленные процессы приводят к нарушению экологии, препятствуют сельскохозяйственной деятельности и приводят к существенному снижению урожайности культур. Также установлено, что солевой стресс отрицательно влияет на эффективность поглощения растениями основных питательных элементов почвы, таких как азот, фосфор и калий, что сдерживает рост и развитие растений, приводит к физиологическим отклонениям и в итоге ставит под угрозу глобальную продовольственную безопасность [3].

Известно, что азот является одним из основных питательных элементов растений и необходим для биосинтеза нуклеиновых кислот, ферментов, фитогормонов, белков и хлорофилла, его недостаток снижает продуктивность культур. Еще одним из основных питательных элементов растений является фосфор. Он участвует в фотосинтезе, синтезе биологически активных веществ, ферментов, образовании АТФ, играет фундаментальную роль в регуляции физиологических процессов и повышает устойчивость растений к абиотическим стрессам (холод, засоление, засуха) [4]. Его недостаток вызывает снижение азотфиксации и урожайности культур. Хотя запасы общего фосфора в почве обильны во многих экосистемах, но в основном они находятся в недоступной для растений форме [5]. Показано, что засоление снижает общее содержание фосфора в почве в среднем на 4–6 %, доступного фосфора на 10–15 % и активность фосфатазы на 25–30 % [6]. Также негативное влияние засоления на биодоступность почвенного фосфора увеличивается с повышением степени и продолжительности засоления.

Во многих странах мира проводятся исследования по восстановлению плодородия засоленных почв и используются такие направления мелиорации, как гидротехнические, химические, органические и биологические [7]. Применение разных способов мелиорации, эффективное управление ресурсами и выведение солеустойчивых сортов растений снижают засоленность, но все эти мероприятия являются очень длительными и дорогостоящими. Также для повышения продуктивности культур ежегодно вносят большие дозы минеральных химических удобрений, но их высокая стоимость и угроза для окружающей среды (загрязнение воды, почвы и др.) мотивируют к поиску альтернативных путей решения проблемы засоленности почв. В этой связи основное внимание уделяется разработке и внедрению безопасных и экологически чистых методов на основе использования полезных микроорганизмов для производства сельскохозяйственных культур на засоленных почвах. Одним из наиболее перспективных решений является применение микроорганизмов, которые присутствуют в ризосфере растений и обладают полезными для них свойствами: способствуют росту и снимают солевой стресс растений на засоленных почвах. Кроме того, эти микробы повышают устойчивость растений к абиотическим стрессам, увеличивают доступность питательных веществ почвы, способны к продукции фитогормонов и сидерофоров, производству летучих органических соединений и метаболитов для предотвращения болезней растений [8; 9]. Однако основными процессами, положительно влияющими на развитие агрокультур на засоленных почвах, являются биологическая фиксация азота и повышение доступности питательных веществ почвы, в частности фосфора. В этой связи использование азотфиксирующих и фосфатмобилизующих бактерий может повысить плодородие почвы, увеличить урожайность культур, улучшить качество продукции и позволит полностью или частично исключить внесение минеральных химических удобрений.

Однако не все микроорганизмы могут активно развиваться в засоленных почвах, большинство из них обладают низкой устойчивостью к засолению. Кроме того, хотя использование этих бактерий может быть эффективной, экологически чистой заменой минеральных удобрений, их способность к фиксации азота и мобилизации фосфатов в условиях высокого солевого стресса практически не исследована, а влияние на рост и развитие сельскохозяйственных культур на засоленных почвах изучено недостаточно.

Цель исследования – изучение способности солетолерантных азотфиксирующих и фосфатмобилизующих бактерий фиксировать азот, мобилизовать фосфаты и поддерживать рост и развитие сельскохозяйственных культур в условиях солевого стресса.

Материалы и методы исследования

Объектами исследования служили солетолерантные азотфиксирующие и фосфатмобилизующие бактерии, выделенные из сильнозасоленных почв юго-востока Казахстана (Алматинская область). Содержание солей в водной вытяжке составляло 1,36 %, значение рН 9,2. По содержанию ионов НСО3- почвы относятся к высокощелочным. Такие почвы вызывают щелочной токсикоз растений, что негативно отражается на их развитии.

В опытах использовали семена основных злаковых культур: пшеница озимая (Triticum aestivum L.) сорт Безостая-1, ячмень (Hordeum vulgare L.) сорт Подольский, овес (Avena sativa L.) сорт Советский-339, кукуруза (Zea mays L.) сорт Будан. В связи с тем, что планируется применять солеустойчивые бактерии на засоленных пастбищах, в опытах использовали смесь семян луговых злаков: тимофеевка луговая (Phleum pratense L.), овсяница луговая (Festuca pratensis L.) и райграс многолетний (Lolium perenne L.), в соотношении 1:1:1.

Изучение азотфиксации бактерий проводили ацетиленовым методом на газовом хроматографе Agilent Technology 7890B (США) [10]. Количество образовавшегося этилена рассчитывали путем измерения концентрации C2H4 в образце, которую определяли по высоте пика образца относительно пика C2H4 эталонного стандарта [11]. Повторность опытов трехкратная.

Фосфатмобилизацию бактерий изучали на среде NBRIP модифицированным методом Сэги [12, с. 135–137]. Индекс растворимости или солюбилизации (SI) рассчитывали как отношение общего диаметра (колония + зона гало) к диаметру колонии. Индекс растворимости (SI) штаммов классифицировали в соответствии со шкалой, где SI < 2 – низкий, 2 > SI < 3 – средний, SI > 3 – высокий [13]. Исследование проводили в пятикратной повторности.

Для изучения биосовместимости бактерий применяли метод перпендикулярных штрихов [14, с. 245–247].

Для изучения влияния бактерий на рост и развитие культур бактерии выращивали на жидких элективных средах. Семена перед посевом стерилизовали, а затем инокулировали суспензией бактерий из расчета 5 мл с тиром 1×108 клеток на 1 г семян в течение 2 ч при комнатной температуре. В контроле семена обрабатывали стерильной водопроводной водой. Обработанные семена раскладывали на чашки Петри с агаризованной средой Ковровцева, солевой стресс создавали, добавляя 2 % NaCl. Через 10 суток проводили подсчет проростков растений, измерение надземной части и корней. Повторность опытов была пятикратной.

Статистическую значимость полученных результатов анализировали с помощью программы STATISTICA 10.0, ver. 6.0 [15, с. 207–208]. Различия считались значимыми при p < 0,05, где значения представлены как среднее значение (M) ± стандартное отклонение (±SEM).

Результаты исследования и их обсуждение

При использовании азотфиксирующих бактерий для засоленных почв одним из наиболее важных показателей является их способность фиксировать молекулярный азот атмосферы при высоком солевом стрессе. Для изучения азотфиксации бактерии выращивали на жидкой среде Эшби, солевой стресс создавали добавлением 500 µмоль NaCl. В табл. 1 представлены данные по накоплению биомассы и нитрогеназной активности у семи штаммов бактерий, ранее показавших наиболее высокие результаты по солеустойчивости.

Из данных табл. 1 следует, что штаммы солеустойчивых азотфиксирующих бактерий активно фиксируют азот атмосферы при высокой степени засоленности, о чем свидетельствуют высокие показатели накопления биомассы (до 2,75 г/л) и нитрогеназной активности. Наиболее высоким накоплением биомассы и нитрогеназной активностью характеризовались три штамма Az3/29, Azp6/2 и Az22, из них лучшие показатели отмечали у штамма Azp6/2. Эти штаммы были отобраны как наиболее эффективные для применения на засоленных почвах.

Для изучения активности мобилизации фосфатов при различной степени засоленности, бактерии выращивали в жидкой среде NBRIP с различными концентрациями NaCl (100, 250 и 500 µмоль). Активность растворения фосфора была рассчитана с помощью индекса солюбилизации (SI). Полученные данные приведены в табл. 2.

Таблица 1

Биомасса и нитрогеназная активность азотфиксирующих бактерий

Примечание: *АСБ – абсолютно сухая биомасса; уровень доверительной вероятности p < 0,05; **p < 0,01.

Таблица 2

Фосфатмобилизующая активность бактерий при солевом стрессе

Примечание: р < 0,05; n = 5.

Результаты исследований показали, что в условиях солевого стресса солеустойчивые бактерии способны активно мобилизовать фосфаты (табл. 2). Так, при концентрации соли в среде 100 µмоль все изоляты характеризовались высокой мобилизацией фосфатов, с увеличением засоленности активность мобилизации фосфатов снижалась. Однако даже при высоком солевом стрессе (500 µмоль NaCl) все изоляты имели индекс солюбилизации (SI) больше 3, что свидетельствует о высокой активности штаммов. Самое высокое значение индекса растворимости фосфата отмечали у штамма FT4 (SI 4,78), далее следовали штаммы FY3 (SI 4,61) и F7A (SI 4,39). Эти показатели свидетельствуют о том, что штаммы являются солеустойчивыми и способны мобилизовать фосфаты при высоком солевом стрессе.

Для применения бактерий в сельском хозяйстве одним из важных показателей является стимуляция роста культур на засоленных почвах. Изучение влияния солетолерантных бактерий на рост основных злаковых культур проводили при засолении, составлявшем 2 %. В опытах использовали азотфиксирующий штамм Azp6/2 и фосфатмобилизующий штамм FT4, которые характеризовались наиболее высокими показателями при солевом стрессе. Известно, что микробный консорциум более эффективно стимулирует рост культур по сравнению с отдельными штаммами. В этой связи был проведен опыт по изучению совместимости штаммов Azp6/2 и FT4. Установлено, что штаммы биосовместимы и на их основе создан микробный консорциум. Штаммы бактерий и их консорциум были использованы для изучения влияния на рост основных злаковых культур и пастбищных трав. Полученные результаты представлены в табл. 3.

Из данных табл. 3 следует, что инокуляция семян штаммами и микробным консорциумом повышала их всхожесть и улучшала рост культур. Было обнаружено, что микробный консорциум более эффективен по сравнению с отдельными штаммами.

Таблица 3

Влияние штаммов бактерий и консорциума на рост и развитие культур

Примечание: уровень доверительной вероятности р <0,05; n = 5.

Так, предпосевная обработка семян консорциумом значительно повысила их всхожесть. При этом всхожесть пшеницы увеличилась до 87 % (контроль 78 %), ячменя – до 76,2 % (контроль 52 %), овса – до 70 % (контроль 48 %), кукурузы – до 80 % (контроль 60 %), пастбищных злаков – до 61 % (контроль 40 %). Также установлено, что длина стебля пшеницы и ячменя увеличилась более чем в 2,5 раза, овса и кукурузы – в 2,0 раза, пастбищных злаков – в 3,5 раза, длина корня пшеницы и ячменя – в 2,0 раза, овса и кукурузы – в 2,5 раза, пастбищных злаков – в 4,5 раза.

Заключение

Таким образом показано, что солеустойчивые азотфиксирующие и фосфатмобилизующие бактерии, выделенные из сильнозасоленных почв, могут активно фиксировать азот атмосферы и мобилизовать нерастворимые фосфаты почвы даже при высоком солевом стрессе, что крайне важно для их применения в сельском хозяйстве на засоленных почвах. Также установлено, что применение штаммов азотфиксирующих и фосфатмобилизующих бактерий и их микробного консорциума оказывает высокое положительное влияние на всхожесть семян, рост и развитие культур и пастбищных трав при засолении. Установлено, что микробный консорциум оказывает более эффективное влияние, чем монокультуры. Солетолерантные штаммы и их консорциум можно рекомендовать для создания биоудобрения, повышающего продуктивность сельскохозяйственных культур на засоленных почвах.