Введение
Золотистый стафилококк (S. aureus) является одним из наиболее клинически значимых оппортунистических патогенов, вызывающих широкий спектр инфекций – от локальных поражений кожи до жизнеугрожающих сепсиса, пневмоний и эндокардитов [1–3]. Постоянные изменения генома стафилококка вынуждают человечество искать новые способы борьбы с ним [4–6]. Одной из ключевых характеристик S. aureus, важной для его вирулентности и диагностики, является способность образовывать скопления (кластеры), напоминающие гроздья винограда. Эта особенность обусловлена неполным расхождением дочерних клеток после деления [7–9].
Классические работы показали, что за агрегацию клеток в значительной степени ответственен белок А – поверхностный белок, ковалентно связанный с пептидогликаном клеточной стенки и обладающий способностью неспецифически связывать Fc-фрагмент иммуноглобулинов G [10]. Однако современные данные указывают на комплексность этого процесса. Помимо белка А, в клеточной адгезии и формировании кластеров участвуют другие поверхностные белки (например, SasG), а также на это влияют особенности синтеза и ремоделирования пептидогликана под действием аутолизинов [11]. Нарушение работы этих систем может приводить к диссоциации кластеров на одиночные кокки, что меняет физические и биологические свойства культуры.
Диметилсульфоксид (ДМСО) – широко используемый в биологических исследованиях полярный апротонный растворитель, обладающий свойствами пенетранта, криопротектора и модулятора клеточной дифференцировки [12]. Известно, что ДМСО в высоких концентрациях (более 5 %) способен ингибировать образование биопленок у S. aureus, что связывают с его воздействием на экспрессию генов вирулентности и общие метаболические процессы [13–15]. Однако влияние низких, субингибиторных концентраций ДМСО (менее 5 %) на морфологию и культуральные свойства стафилококков изучено недостаточно. Такие концентрации часто используются в экспериментах для растворения гидрофобных соединений, при этом его собственное влияние учитывается не всегда.
Цель исследования – изучение влияния субингибиторных концентраций ДМСО (0,5–5 %) на морфологию кластеров, свойства клеточной стенки и количество КОЕ Staphylococcus aureus.
Материалы и методы исследования
Для оценки дисагрегационного эффекта субингибиторных концентраций ДМСО использовались суспензии S. aureus в физиологическом растворе. Контрольная и опытные суспензии высевались газоном на солевой агар (Стафилококкагар, ТУ 9398-109-78095326-2010). Инкубирование проводилось в суховоздушном термостате СКТБ ТС-1/20 при температуре 37 ºС в течение 48 ч. Изучение мазков производилось с помощью микроскопа «Микромед Р-1 led» с масляной иммерсией. Подсчет колоний производился с помощью стереомикроскопа МС-1 вар.2C.
Результаты исследования и их обсуждение
Исследования показали, что низкие концентрации ДМСО увеличивают число КОЕ S. aureus по сравнению с контрольными посевами (рис. 1). Это можно объяснить разрушением гроздевидных структур с распадом до более мелких групп и отдельных кокков, каждый из которых может дать собственную колонию на питательной среде. Максимальное увеличение числа КОЕ отмечено при концентрации ДМСО 3 %. Уменьшение этого значения при увеличении концентрации КОЕ до 5 % можно объяснить либо выкристаллизовыванием растворителя (рис. 2), либо началом ингибирующего его действия на клетки бактерий [12].
При микроскопировании отмечается уменьшение числа клеток в агрегатах и увеличение числа одиночных клеток в колониях, подвергнутых воздействию ДМСО. Также в них клетки хуже воспринимают окраску по Граму, демонстрируя более розовый оттенок (рис. 3, 4). Помимо этого, отмечен характерный «ползучий рост» колоний, указывающий на снижение агрегационной способности материнских клеток (рис. 5).
Рис. 1. Повышение числа КОЕ S. aureus при воздействии на исходную суспензию низких концентраций ДМСО Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования
Рис. 2. Кристаллизация ДМСО в суспензии микроорганизмов, х1600 Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования
Рис. 3. Мазок колонии S. aureus из контрольной серии, х1600, окраска по Граму Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования
Рис. 4. Мазок колонии S. aureus из опытной серии при воздействии 5 % ДМСО, х1600, окраска по Граму Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования
Рис. 5. Характерный «ползучий рост» колоний S. aureus (в центре чашки) при концентрации ДМСО в опытной суспензии 5 % Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования
Полученные результаты демонстрируют комплексное воздействие малых концентраций ДМСО (0,5–5 %) на S. aureus. Наблюдаемое разделение кластеров согласуется с гипотезой о воздействии растворителя на поверхностные структуры клетки. ДМСО, известный своим свойством нарушать водородные связи и проникать через липидные бислои, мог:
− модифицировать белок А: изменение конформации или маскировка белка А может нарушить его роль в агрегации клеток;
− влиять на аутолизины: ДМСО может модулировать активность ферментов, ответственных за разделение дочерних клеток (например, амидазы Atl), приводя к их преждевременной или неполной активности;
− изменять свойства пептидогликана и плазматической мембраны: это объясняет неопределенный результат окраски по Граму, которая зависит от целостности и заряда клеточной стенки. Денатурирующее действие ДМСО на белки может повышать проницаемость стенки для красителей.
Данные дополняют работы прошлых лет, показывая, что даже крайне низкие концентрации ДМСО (0,5–5 %) не влияющие на образование зрелой биопленки, способны влиять на первичную адгезию и кластерообразование – ключевые начальные этапы формирования биопленки и колонии [11, 12].
Результаты подчеркивают необходимость строгого учета эффекта ДМСО в экспериментах. Его использование в качестве растворителя при скрининге антимикробных или антибиопленочных соединений против S. aureus может привести к ложноположительным результатам – синергическому эффекту за счет диссоциации кластеров исследуемым веществом и ДМСО.
Выводы
1. Субингибиторные концентрации ДМСО (0,5–5 %) вызывают диссоциацию характерных кластеров S. aureus на одиночные кокки и мелкие группы.
2. Обработка ДМСО приводит к изменению свойств клеточной стенки, что проявляется в грамвариабельной окраске, что указывает на структурные изменения пептидогликана и/или поверхностных белков.
3. Наблюдаемое значительное увеличение числа КОЕ после воздействия ДМСО является методическим артефактом, обусловленным физическим разделением уже существовавших в суспензии кластеров, а не стимуляцией размножения бактерий.
4. Феномен «ползучего роста» на газонных посевах подтверждает гипотезу о снижении адгезивной способности клеток под действием ДМСО.
5. Полученные данные необходимо учитывать при планировании экспериментов с использованием ДМСО в качестве растворителя для изучения свойств S. aureus, особенно при подсчете КОЕ и оценке антибиопленочной активности.