Разработана кинетическая модель экспресс-тестирования антиоксидантной активности (АОА) различных классов органических соединений в условиях, приближенных к условиям биологической среды. Показано, что скорость окисления модельных липидов в водно-эмульсионной среде в 1000 раз выше, чем в безводной среде. Подобраны оптимальные условия каталитического окисления эфиров высших ненасыщенных жирных кислот в водно-эмульсионной среде в зависимости от природы и концентрации солей металлов переходной валентности и поверхностно-активного вещества. Исследована АОА важнейших органических ингибиторов в сравнении со стандартными антиоксидантами дибунолом и a-токоферолом в водно-липидных катализируемых субстратах.
В связи с широким внедрением ингибиторов окисления, актуальной является проблема предварительного тестирования их антиоксидантной активности. Поскольку большинство известных моделей для тестирования антиоксидантов являются гидрофобными, представлялось актуальным подобрать гидрофильную липидную систему и проверить её эффективность на примере известных химических соединений, предположительно имеющих антиоксидантную активность, сравнить их действие с реперными ингибиторами окисления. Известны многочисленные работы по тестированию активности катионов металлов, которые относятся, в основном, к катализу гомогенных липидных систем [1, 2, 3, 4]. Эти результаты имеют ограниченное значение для описания процессов окисления, протекающих в мицеллах и живой клетке. Мало работ, в которых сравниваются антиоксидантные свойства соединений различных классов в безводной и водно-эмульсионной средах (ВЭС) в условиях инициирования и катализа.
Целью данного исследования являлась разработка кинетического способа тестирования антиоксидантной активности различных классов органических соединений (фенолов, аминов, серосодержащих соединений), в условиях, приближенных к биологическим средам, изучение антиоксидантной активности ряда полифункциональных соединений в сравнении с реперными антиоксидантами дибунолом и a-токоферолом.
Экспериментальная часть
Антиоксидантную активность (АОА) изучали манометрическим методом поглощения кислорода в модифицированной установке типа Варбурга при окислении модельного субстрата (метиллинолеата (МЛ) и этилолеата (ЭО)) в присутствии триметилцетиламмоний бромида (ЦТМАБ) в качестве поверхностно-активного вещества (ПАВ) (10–4–10–2 М), с добавками растворов солей металлов в количестве (10–6–10–1 М) при t = (60 ± 0,2) °С. Соотношение воды и эфира составляло 3:1, а общий объем пробы 4 мл [5]. Кинетику поглощения кислорода в безводной среде изучали в среде инертного растворителя хлорбензола, процесс инициировали за счет термического разложения азо-бис-изо-бутиронитрила (АИБН) в концентрации 6∙10–3 М. Графическим методом определяли величину периода индукции (ti), представляющей собой отрезок оси абсцисс, отсекаемый перпендикуляром, опущенным из точки пересечения касательных, проведенных к кинетической кривой. Эффективность торможения процесса окисления липидного субстрата определяется совокупностью реакций ингибитора и обозначает его антиоксидантную активность, количественно определяемой по формуле АОА = ti – tS/tS, где tS и ti – периоды индукции окисления субстрата в отсутствие и в присутствии исследуемого АО соответственно. В качестве реперных ингибиторов использовали a-токоферол (a-ТФ) и дибунол, при этом концентрации АО были сравнимыми.
Результаты и их обсуждение
Разработка кинетического метода базировалась на исследовании активности солей переходных металлов: FeSO4, FeCl3, NiCl2, CoCl2, CuCl2 в водно-липидных субстратах. С целью выбора наиболее эффективного катализатора изучали в сравнительном аспекте влияние упомянутых выше солей на процесс окисления МЛ. Более детальное изучение кинетики окисления липидных субстратов в присутствии металлов переменной валентности было показано раннее в работе [5].
Действие упомянутых выше солей было изучено в широком диапазоне концентраций для отбора среди них наиболее эффективных катализаторов. В результате исследований установлено, что аутоускоренный характер имеет кинетика окисления водно-липидных субстратов в присутствии катионов Fe2+, Co2+ и Cu2+. Характер кинетических кривых окисления липидных субстратов в зависимости от концентрации катионов позволил предполагать преобладающее участие Fe3+, Ni2+ в обрыве цепей, участие Fe2+, Co2+, Cu2+ в зарождении и разветвлении цепей. Зависимости скорости окисления метиллинолеата от концентрации солей металлов носят экстремальный характер, экстремумы проявляются в разных диапазонах. Скорости окисления липидных субстратов в присутствии солей NiCl2 и FeCl3 выходят на максимум при концентрациях 1,0∙10–3 М, далее с ростом концентрации их значение не меняется и составляет (4,0 ± 0,2)∙10–5 М∙с–1 и (5,0 ± 0,3)∙10–5М∙с–1 соответственно. Максимальная скорость при окислении с добавками сульфата железа отмечается в диапазоне (0,1–1,0) М и составляет (9,4 ± 0,4)∙10–5 М∙с–1, при дальнейшем росте концентрации – остается постоянной и составляет (6,0 ± 0,2)∙10–5 М∙с–1. Зависимость Wmax систем с добавками хлорида кобальта имеет «пик» при концентрации (9 – 11)∙10–3 М, при которой ее величина составляет (24,4 ± 0,4)∙10–5 М∙с–1. Хлорид меди по своим каталитическим свойствам выделяется среди всех исследуемых веществ. Скорость окисления в присутствии хлорида меди выше в 5 раз, чем в присутствии других солей металлов переменной валентности и при концентрации 2∙10–3 М составляет (26,3 ± 0,3)∙10–5 М∙с–1(табл. 1).
Таблица 1
Кинетические параметры окисления метиллинолеата в присутствии солей железа (II, III), никеля (II), кобальта (II) и меди (II) в ВЭС, t = 60 °С, СЦТМАБ = 1∙10–3 М, вода:липиды – 3:1
|
Катализатор |
Fe2+ |
Fe3+ |
Ni2+ |
Co2+ |
Cu2+ |
Fe2+ |
Fe3+ |
Ni2+ |
Co2+ |
Cu2+ |
|
[Кат.], М |
2⋅10−3 |
1∙10−3 |
||||||||
|
Wнач∙10–5, М∙с–1 |
6,8 |
1,7 |
2,4 |
14,2 |
14,4 |
6,8 |
2,3 |
3,5 |
11,4 |
8,6 |
|
Wmax∙10–5, М∙с–1 |
6,1 |
3,5 |
3,2 |
7,3 |
26,3 |
5,9 |
3,2 |
4,1 |
6,8 |
14,5 |
В нашем эксперименте каталитическая активность солей металлов уменьшается в ряду: Cu2+ > Fe2+ > Fe3+ > Co2+ > Ni2+. Ранее каталитическое действие металлов переменной валентности изучалось при окислении растительных масел и модельных липидных субстратов [1, 3, 4, 6]. Был получен ряд каталитической активности: Cu2+ > Mn2+ > Fe2+ > Cr2+ > Ni2+ >> Zn2+. Как видно из приведенных выше данных изученные соли вписываются в указанный ряд активности металлов, а хлорид меди обладает наибольшей каталитической активностью при наименьшей концентрации 2∙10–3 М.
Следующим этапом создания модели для тестирования антиоксидантов был выбор концентрации ЦТМАБ. Известно [7], что скорость окисления в гомогенных системах ниже, чем в эмульсиях и зависит от степени ее дисперсности. В работе [1] установлено, что соотношение констант скорости роста и обрыва цепи при инициированном окисление кумола в эмульсиях и гомогенной системе соотносится как 5,5:1 и равно 110 и 20 соответственно.
Нами также было установлено, что скорость окисления МЛ в водно-эмульсионной среде ~ в 1000 раз выше, чем в безводной среде.
При выборе оптимальной концентрации ЦТМАБ исследовали диапазон (10-4–10−2) М. Установлено, что с ростом концентраций ПАВ скорость процесса проходит через максимум, соответствующий концентрации 1∙10−3 М. Дальнейшее повышение концентрации ЦТМАБ приводит к снижению скорости окисления. Указанную концентрацию детергента, обеспечивающую наибольшую скорость реакции, можно рекомендовать для использования в гетерогенных моделях окисления. Методом Ребиндера и рефрактометрически была определена критическая концентрация мицеллообразования ЦТМАБ (1,0 ± 0,2)∙10−3 М, что соответствовало кинетическим данным.
При низких концентрациях катионы катализатора имеют большую вероятность донорно-акцепторного взаимодействия с эфирными группами субстрата, приводящего к образованию в присутствии катализатора свободных радикалов по реакции:
Me(n+1)+ + RH + O2 → Men+ + R° + H+
Механизм действия металлов связывают с каталитическим разрушением гидропероксидов в соответствии с реакциями [1]:
ROOH + Fe3+ → RO2° + H+ + Fe2+
ROOH + Cu2+ → RO2° + H+ + Cu1+
ROOH + Fe2+→ RO2° + H+ + Fe3+
Образующиеся при этом алкоксильные и пероксильные радикалы участвуют в дальнейшем в реакциях продолжения цепей окисления. Катионы металлов могут конкурентно участвовать в обрыве цепей, что должно приводить к замедлению процесса на глубоких стадиях окисления. Замедление процесса возможно также за счет перехода катиона металла в менее активную форму.
На основе проведенных исследований была предложена новая кинетическая модель для тестирования биоантиоксидантов. Модельный субстрат содержит 2∙10−3 М хлорида меди (II), 1∙10−3 М ЦТМАБ, липиды (ЭО, МЛ) и воду, соотношение липиды-вода 1 : 3.
В настоящем работе приведены результаты исследования кинетики каталитического окисления липидного субстрата в водно-эмульсионной среде в присутствии ряда полифункциональных соединений. Ряд производных фенола составили: парацетамол, осалмид. Ряд двухатомных фенолов представляли: адреналин, метилдофа. В качестве гетероциклических производных использовались: фентоламин, аллопуринол, эмоксипин. В качестве аминов исследовали: новокаин, коринфар. В качестве серосодержащего соединения изучали капотен. Реперными АО послужили a-токоферол и дибунол.
В нашем исследовании показан идентичный характер кинетических кривых при окислении липидных субстратов в растворе хлорбензола в присутствии 6∙10−3 М инициатора (АИБН) и водно-эмульсионной системе в присутствии 2∙10−3 М хлорида меди при разных концентрациях дибунола. Показано, что в водно-эмульсионной среде дибунол проявляет себя как сильный ингибитор: наблюдается период полного торможения, период аутоускорения и достижение максимальной скорости окисления. Периоды индукции увеличиваются пропорционально увеличению концентрации дибунола. Наличие торможения в присутствии добавок дибунола является признаком радикально-цепного механизма процесса. По наклону прямой в координатах t, [InH] была рассчитана скорость инициирования в обеих системах, получены значения 6,2∙10-8 и 6,7∙10-5 М∙с–1 в безводной и водно-эмульсионной системе соответственно. Сравнение максимальных скоростей окисления ЭО при t = (60 ± 0,2) °С в безводной и водно-эмульсионной средах равных 1,3∙10-7 и 1,4∙10-4 М∙с–1 соответствует различию скоростей инициирования ~ в 1000 раз.
Показано, что реперный биоантиоксидант a-токоферол в ВЭС проявлял слабые антиоксидантные свойства, в концентрациях свыше 1∙10−3 М промотировал процесс окисление липидных субстратов (табл. 2). Полученные результаты указывают на более сложный механизм действия a-токоферола в катализируемом субстрате. Причиной ускорения процесса может быть комплексообразование OH-группы a-токоферола с катализатором. В процессе окисления a-токоферол образует достаточно активные токофероксильные радикалы, способные участвовать в побочных реакциях продолжения цепей с молекулами субстрата (RH):
In• + RH → R• + InH
Поскольку известно [8, 9, 10], что в углеводородной среде увеличение АРА фенолов происходит под влиянием электронодонорных заместителей, рассмотрим полученные ряды соединений в зависимости от структуры. В соответствии с теорией, ингибиторы условно делятся на сильные и слабые. Сильные ингибиторы эффективно тормозят окисление, участвуя только в реакциях обрыва цепей. Кинетика такого процесса характеризуется периодом полного торможения, аутоускорением и достижением максимальной скорости. Слабые ингибиторы способны не только обрывать цепи, но из-за высокой активности своих радикалов, участвовать в реакциях продолжение цепей. Кинетика такого процесса характеризуется отсутствием периодом полного торможения, достаточно высокими начальными скоростями, аутоускорением на определенном уровне окисления, достижением максимальной скорости. Алкилированные в пара- и орто-положения фенолы, двухатомные фенолы считаются сильными нигибиторами. Каждая алкильная или гидроксильная группа увеличивает АОА на определенную величину. Ингибитор тем эффективнее, чем меньше полярность и больше размер заместителя в пара-положении. В связи с этим нами детально изучалась зависимость изменения периодов индукции от концентрации исследуемых АО.
Установлено, что все исследуемые концентрации осалмида уменьшали начальную и максимальную скорости окисления в 5 раз по сравнению с контролем. Высокая эффективность торможения осалмида связана с участием в реакциях обрыва цепей. Во всем диапазоне изученных концентраций парацетамол снижал начальную и максимальную скорости окисления, по сравнению с контролем в 2–5 раз, проявляя высокую АОА, уступая только осалмиду (табл. 2). Взаимосвязь между периодами индукции и концентрацией адреналина и метилдофы во всем изученном диапазоне положительная. Очевидно, что в производных пирокатехина орто-гидроксильные группы связаны комплексообразованием с солями меди. Поэтому, высокая антиоксидантная активность адреналина и метилдофы, снижение максимальной скорости окисления может свидетельствовать об участии аминов в реакциях с гидропероксидами с образованием молекулярных продуктов.
Рассмотрим ряд гетероциклических производных: фентоламин, аллопуринол, эмоксипин. Фентоламин относится к амино-фенолам первой группы, в присутствии которых при различных концентрациях происходит окисление мицеллярного субстрата без периода индукции и периода аутоускорения. Низкая АОА фентоламина может быть обусловлена нарушением сопряжения из-за объемного заместителя в положении 3. Показано, что при всех концентрациях эмоксипин тормозит начальные и максимальные скорости окисления. В присутствии аллопуринола и эмоксипина наблюдаются периоды индукции и периоды аутоускорения. Соединения относятся к амино-фенолам второй группы. Вероятно, в этих условиях лимитирующей является реакция разрушения амином гидропероксидов по молекулярному механизму. Зависимости периодов индукции от концентрации эмоксипина, аллопуринола и фентоламина приведены в табл. 2.
Таблица 2
Кинетические параметры окисления липидных субстратов в водно-эмульсионной среде в присутствии 2⋅10−3 М CuCl2 в зависимости от концентрации АО, t = 60°С
|
№ п/п |
С(АО), М |
τi, мин |
Wнач∙10–5, М∙с–1 |
Wmax∙10–5, М∙с–1 |
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
I Парацетамол |
||||
|
1 |
Контроль ЭО |
15 |
7,5 |
14,0 |
|
2 |
1∙10-4 |
20 |
6,2 |
10,0 |
|
3 |
1∙10−3 |
40 |
2,5 |
3,1 |
|
4 |
1∙10−2 |
45 |
2,0 |
2,4 |
|
II Осалмид |
||||
|
5 |
Контроль ЭО |
15 |
7,5 |
14,0 |
|
6 |
1∙10-4 |
45 |
2,9 |
4,4 |
|
7 |
1∙10−3 |
350 |
0,6 |
2,7 |
|
8 |
1∙10−2 |
500 |
0,4 |
2,5 |
|
III Адреналин |
||||
|
9 |
Контроль ЭО |
15 |
7,5 |
14,0 |
|
10 |
1∙10-4 |
30 |
3,4 |
4,6 |
|
11 |
1∙10−3 |
40 |
2,1 |
4,5 |
|
12 |
1∙10−2 |
60 |
0,9 |
3,8 |
|
IV Метилдофа |
||||
|
13 |
Контроль ЭО |
15 |
7,5 |
14,0 |
|
14 |
1∙10-4 |
30 |
6,8 |
8,8 |
|
15 |
1∙10−3 |
35 |
3,4 |
5,1 |
|
16 |
1∙10−2 |
60 |
0,9 |
2,4 |
|
V Фентоламин |
||||
|
17 |
Контроль ЭО |
15 |
7,5 |
14,0 |
|
18 |
1∙10-4 |
15 |
7,4 |
13,7 |
|
19 |
1∙10−3 |
20 |
6,8 |
13,8 |
|
20 |
1∙10−2 |
55 |
6,1 |
13,4 |
|
VI Аллопуринол |
||||
|
21 |
Контроль ЭО |
15 |
7,5 |
14,0 |
|
22 |
1∙10-4 |
50 |
3,7 |
5,3 |
|
23 |
1∙10−3 |
70 |
3,5 |
5,5 |
|
24 |
1∙10−2 |
80 |
2,6 |
5,6 |
|
VII Эмоксипин |
||||
|
25 |
Контроль ЭО |
15 |
7,5 |
14,0 |
|
26 |
1∙10-4 |
40 |
2,1 |
4,3 |
|
27 |
1∙10−3 |
55 |
1,0 |
3,5 |
|
28 |
1∙10−2 |
90 |
0,7 |
2,6 |
|
Окончание табл. 2 |
||||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
|
VIII Новокаин |
||||
|
29 |
Контроль ЭО |
15 |
7,5 |
14,0 |
|
30 |
1∙10-4 |
45 |
6,7 |
9,2 |
|
31 |
1∙10−3 |
50 |
6,5 |
7,6 |
|
32 |
1∙10−2 |
70 |
5,7 |
6,8 |
|
IX Коринфар |
||||
|
33 |
Контроль ЭО |
15 |
7,5 |
14,0 |
|
34 |
1∙10-4 |
26 |
4,9 |
7,0 |
|
35 |
1∙10−3 |
50 |
3,9 |
5,0 |
|
36 |
1∙10−2 |
100 |
1,4 |
2,5 |
|
X Капотен |
||||
|
37 |
Контроль МЛ |
5 |
14,4 |
26,3 |
|
38 |
1∙10-4 |
26 |
6,2 |
16,9 |
|
39 |
1∙10−3 |
45 |
3,6 |
17,6 |
|
40 |
1∙10−2 |
95 |
2,1 |
17,5 |
|
41 |
1∙10−1 |
395 |
0,6 |
17,4 |
|
XI Дибунол |
||||
|
42 |
Контроль ЭО |
15 |
7,5 |
14,0 |
|
43 |
1∙10-4 |
140 |
2,1 |
8,7 |
|
44 |
5∙10-4 |
360 |
1,3 |
8,4 |
|
45 |
1∙10−3 |
600 |
1,0 |
8,0 |
|
XII a-Токоферол |
||||
|
46 |
Контроль МЛ |
5 |
14,4 |
26,3 |
|
47 |
1∙10-4 |
35 |
5,2 |
14,3 |
|
48 |
1∙10−3 |
15 |
14,6 |
32,2 |
|
49 |
1∙10−2 |
6 |
15,7 |
34,4 |
|
50 |
1∙10−1 |
5 |
16,8 |
57,3 |
В качестве серосодержащего соединения в настоящей работе был изучен капотен. Показано, что все добавки капотена тормозят процесс окисления, снижая начальную и максимальную скорости (табл. 2). Вероятно, капотен (R1–SH) участвует в реакциях обрыва цепей, обеспечивая ингибирования процесса окисления, снижение скорости окисления обусловлено его конкурентным участием с катализатором в распаде гидропероксидов по молекулярному механизму, что влияет на снижение скорости разветвления цепей и скорости процесса в целом:
RO2°+ R1–SH → ROOH +R1–S°
ROOH + R1–S–R2 → R1–SO–R2 + ROH
ROOH + Cu2+ → RO2°+ H+ + Cu1+
Выводы
1. Разработана кинетическая модель тестирования биоантиоксидантов в водно-эмульсионной каталитической среде, выбраны оптимальные концентрации катализатора и поверхностно-активного вещества.
2. Получен ряд каталитической активности солей металлов переменной валентности: Cu2+ > Fe2+ > Fe3+ > Co2+ > Ni2+.
3. Показан идентичный механизм действия стационарного антиоксиданта дибунола при окислении безводных и водно-эмульсионных липидных субстратов.
4. Получен ряд увеличения антиоксидантной активности полифункциональных соединений: фентоламин < новокаин < аллопуринол < парацетамол < коринфар < адреналин < метилдофа < эмоксипин < капотен < осалмид < дибунол.
По результатам тестирования антиоксидантной активности ряда ингибиторов окисления было выявлено наиболее эффективное соединение – осалмид. В Новосибирском институте органической химии (НИОХ) им. Н.Н. Ворожцова СО РАН на базе структуры осалмида была синтезирована группа замещенных амидов и сульфидов салициловой кислоты, имеющих в орто- и пара-положении экранирующие трет-бутильные заместители. Сравнительному тестированию ингибирующих свойств новых перспективных соединений с целью выявления среди них активных антиоксидантов будет посвящена отдельная работа.