Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Из проростков гороха Pisum sativum Lизолирован ингибитор подавляющий рост дрожжевых культур, нуждающихся вэкзогенной пантотеновой кислоте [6] ивысших растений [7]. Его действие устраняется только витамином пантотеновой кислотой (ПК), ион классифицирован как антивитамин пантотеновой кислоты иполучил условное название Пизамин так как обнаружен увсех видов рода Pisum [8]. Подавляя ПК вбиохимических реакциях он не является её конкурентным антагонистом, совершенно не влияет на её биологический синтез ипроявляет биологическое действие только вприсутствии ПК [9] Идентификация показала, что это водорастворимый олигосахарид, состоящий из остатков простых сахаров: арабинозы (3,35 %), рибозы (7,85 %), ксилозы (11,3 %), маннозы (2,8 %), галактозы (10,7 %), глюкозы (36,4 %) игалактуроновой кислоты (27,6 %) [10]. Учитывая тот факт, что ПК входит всостав многофункционального (катализирует око­ло 130 биохимических реакций) кофермента (КоА), который признан единственной активной формой ПК [5] Поэтому мы считаем, что пизамин является антикоферментом КоА. Влитературе описаны факты присутствия вводных экстрактах растений антикоферментов СоА [3]. Вопытах in vitro вэкстрактах подсолнечника, фасоли, обнаружены ингибиторы ацетилирования сульфаниламида, иавторы заключили, что торможение ацетилирования связано сналичием вэкстрактах полифенольных соединений. Вданном сообщении представлены исследования, направленные на доказательство антиметаболического антикоферментного действия пизамина вотношении КоА на некоторые биохимические ифизиологические процессы, вкоторых непосредственно участвует КоА

Материалы иметоды иследования

В качестве тест-объекта использовали проростки гороха Pisum sativum L, вырашиваемые на свету ив темноте, иозолированные семядоли огурца ( Cucumis sativum L) икабачка (Cucurbita pepo L), листья фасоли. Реакцию ацетилировпания ПАБК проводили по методу Липмана, вмодификации Сытинской О.Н. [12] итрансацетилирования по методу Mc Dongal D.B. иGargar R.V. [15]. Содержание хлорофилла определяли вспиртовой вытяжке на фотоэлектроколориметре КФК–2 МП свычислением содержания количества хлорофилла по калибровочной кривой ивыражали вмг/г сырого веса [2]. Продуктивность фотосинтетического аппарата определяли влистьях фасоли, сравнивая содержание углерода вконтрольных иопытных листьях, после сжигания вхромовой смеси (1). Семена фасоли замачивали втечение 24 часов, инабухшие семена помещали во влажный прокаленный речной песок для проращивания. Четырехдневные одинаковые по размеру проростки пересаживали на раствор Кнопа по 3 штуки на сосуд иежедневно освещали по 9 часов втечение 14 дней. Перед анализом все растения помещали втемноту на 48 часов для расходования продуктов фотосинтеза. Упобегов удаляли верхушки, аснизу подрезали над семядольными листьями. Втаком состоянии черенки слистьями помешали вколбочки Бунзена сраствором, содержащего 300мкг/мл пизамина иинфильтрировали влистья под вакуумом втечение 30 минут. Контрольный вариант инфильтрировали дистиллированной водой. Вопыт брали первую пару настоящих листьев: один лист брали для определения исходного содержания углерода, авторой вместе спобегом погружали вводу ивыставляли на свет на 20 часов, после чего вних определяли содержание углерода. Скаждого листа после насыщения вводе втечение 30 минут брали по 6 высечек пробочным сверлом диаметром 1 см, Повторность 4-кратная. Высечки переносили впробирки с10 мл хромовой смеси ивместе свысечками кипятили 5 минут на песочной бане, изатем определяли по оптической плотности содержание углерода вмг/дм 2/час. Растения выращивали вфотостате под лампой ДРЛ 250 wна 1 м2.

Результаты исследования иих обсуждение

Механизм действия пизамина был изучен in vitro на реакциях, которые непосредственно осуществляются катализом КоА или его участием вкачестве субстрата вметаболических реакция. Втаких опытах более конкретно увязана связь пизамина сКоА. Мы использовали самый показательный классический опыт реакцию ацетилирования ПАБК [ 12] Результаты показали, что пизамин подавляет эту реакцию КоА.

Рис. 1.Подавление пизамином ацетилирующей активност КоА

Как показано на графике рис.1, пизамин подавляет процесс вклассичекой форме зеркальной зависимости, указывая, что пизамин связан сэтой реакций, сильно подавляя процесс. Уже 1 мг пизамина вреакционной среде подавляет 6 мг КоА на 28,85 %, 5 мл пизамина подавляет уже на 51,59 мг, а10 мг– почти полностью подавляет реакцию. Вколичественном отношении это соответствовало ацетилированию ПАБК вконтроле 7,23±0,35 мкг/час, ав опыте, соответственно, 3,5±0,31 и0,35±0,0 мкг/ч.

Также как возрастающие концентрации пизамина усиливают подавление активности КоА, так иобратная реакция, возрастание концентрации КоА снижают подавляющее действие пизамина вдругой специфической реакции, трансацетилирования КоА.

Так из данных табл.1 видно, что возрастающие концентрации КоА, содержащиеся вреакционной среде, снижали подавляющее действие пизамина на реакцию транскарбоксилирования иобразование эфира фосфотрансацетилазой, катализируемую КоА. Как видим, возрастающие концентрации КоА при стабильном содержании пизамина повышают активность реакции, снижая % её подавления пизамином. Так 100мкг КоА, содержащиеся вреакционной среде, снижали подавление реакции пизамином до 43,5 %, 200 мкг– до 33,0 %, 300мкг – до 23,0 % и400 мкг –до 18,0 %

Таблица 1

Инактивация КоА подавляющего действия пизамина на реакции трансацетилирования

Таким образом, проведенные исследования, убедительно свидетельствуют, что механизм действия пизамина из проростков гороха проявляется вантивитаминном действии через ПК, подавляя биокаталитические функции её активного производного КоА. Следовательно, есть полное основание считать, что пизамин ингибитор КоА, т.е. его антикоферемент.

Учитывая довольно широкий спектр реакций, катализируемых КоА (около130) пизамин как его ингибитор может участвовать вподавлении большинства метаболических процессов.

Мы полагаем, что одним из таких процессов может быть процесс синтеза хлорофилла. Известно, что синтез хлорофилла имеет две фазы (темновая исветовая), которые отличаются условиями иходом реакций. Впервой фазе происходит образование предшественников биохимическим путем сучастием КоА ине нуждаются всвете. Во второй фазе предшественник протохлорофиллид за счет световой энергии превращается вхлорофилл «а». Биохимический этап биосинтеза хлорофилла начинается собразования из сукцинил-КоА иглутамата или кетоглутарата первичного предшественника хлорофилла аминолевуленовой кислоты вприсутствии АЛК-синтетазы (13)

Действие экзогенного пизамина на синтез хлорофилла изучали in vitro, на изолированных семядолях огурца (Сucumis sativum L) икабачка (Сucurbita pepo L). Семена предварительно замачивали вдистиллированной воде на сутки, затем семядоли отделяли от кожуры ипомещали вчашки Петри на водные растворы, содержащие 1; 2 и3мг/мл пизамина. Семядоли выдерживали втечение 3-х суток на непрерывном свету для синтеза хлорофилла.

Таблица 2

Подавление пизамином синтеза инакопления хлорофилла в изолированных семядолях огурца икабачка

Как видим, повышение концентрации экзогенного пизамина всреде приводит кснижению содержания хлорофилла визолированных семядолях огурца икабачка (табл.2) Вэтих опытах, несомненно также доказывается связь действия пизамина на биокаталитичес-кие функциями КоА, т.е. проявляется антикоферментное действие пизамина.

На наш взгляд, интересным является то, что пизамин, оказывая подавляющее влияние на формирование пигментной системы фотосинтетического аппарата, оказал влияние ина метаболические процессы фотосинтеза, подавляя фотосинтетическую активность. Влитературе известно, что влистьях целого ряда высших растений: клевера белого, кукурузы, примулы, элодеи, атак же вклетках зеленых водорослей хлореллы, сценедесмуса, дуналиелы обнаружено комплексное соединение железа сКоА. Сучастием такого железосодержащего-КоА происходит процесс фиксации СО2 иеё восстановление при фотосинтезе [4].

Поэтому нами было изучено влияние экзогенного пизамина на усвоение инакопления углерода впроцессе фотосинтеза. Эта работа была проведена всравнении сгомо ПК (гомопантотеновая кислота), природным аналогом ПК. Она является природным конкурентным антагонистом ПК (11, 15), испособствует образованию неактивной формы КоА, апизамин, по нашим данным, оказывает влияние на функции КоА. Ив том, ив другом случае, испытанные антивитаминные факторы ПК, оказали подавление продуктивности фотосинтеза, причем пизамин оказался намного активным (табл. 3).

Таблица 3

Влияние пизамина игомоПК на усвоение инакопление углерода впроцессе фотосинтеза влистьях фасоли

Четко проявляется торможение эндогенным пизамином синтеза хлорофилла в12-дневных проростков гороха вэпикотиле и2-м междоузлиях, вкоторых он максимально накапливается. Содержание хлорофилла вмеждоузлиях коррелирует ссодержанием вних эндогенного пизамина (табл. 4)

Таблица 4

Влияние содержания эндогенного пизамина на накопление хлорофиилла на свету вмеждоузлиях 12-дневные проростки гороха

Высокое содержание эндогенного пизамина вдвух нижних междоузлиях также резко подавляет их линейный рост ипрепятствует формированию на их узлах настоящих листьев, вместо которых образуются пластинки катафиллы. Уэтиолированных проростков счетырьмя междоузлиями после выставления на свет синтезе хлорофилла наблюдался хорошо влистьях и2-х верхних междоузлиях, вэпикотиле ивтором междоузлиях хлорофилл не обнаруживался.

Это ещё раз убедительно доказывает, что пизамин оказывает антивитаминное действие на процессы, связанные сфункциями КоА, через подавление метаболических процессов.

Таким образом, изучение антивитамина ПК из проростков гороха Pisum sativum Lна процессы, снепосредственным участием активного производного пантотеновой кислоты КоА показало, что пизамин тормозит реакцию ацетилирования ПАБК, авозрастающие концентрации КоА вызывает торможение действия пизамин на реакции трансацетилирования. Пизамин подавляет синтез хлорофилла визолированных семядолях огурца икабачка. Инфильтрация раствора пизамина впервичные листья 14-дневных проростков фасоли пизамина игомопантотеновой кислоты, конкурентного антивитамина ПК, вызывала подавление усвоение углерода впроцессе фотосинтеза, причем пизамин был намного активнее. Впроростках гороха in vivо содержание хлорофилла вмеждоузлиях коррелирует ссодержанием вних эндогенного пизамина, который резко тормозит илинейный рост эпикотиля ивторого междоузлия, препятствует образованию на их узлах настоящих листьев. Упозеленевших этиолированных проростках гороха вэпикотиле ивтором междоузлиях хлорофилл не обнаруживался.

Следовательно, по механизму антивитаминного действия пизамин впроростках гороха является природным ингибитором КоА, т. е. его антикоферментом.