Повсеместно увеличивается число инфекций, вызванных патогенными резистентными бактериями. Низкая активность лекарственных препаратов к грамотрицательным бактериям обусловлена развитием лекарственной устойчивости к синтетическим антибиотикам или препаратам, полученным из лекарственных растений. В течение 60 лет в медицинской практике и ветеринарии для лечения бактериальных и некоторых протозойных инфекций применяются препараты – производные 5-нитрофурана. Нитрогруппа имеет существенное значение для проявления антимикробных свойств ряда химических соединений (нитрофуранов, нитроимидазолов и хлорамфеникола) [1]. Вместе с тем перспективными антибактериальными препаратами являются производные селеноорганического препарата ДАФС-25, применяемого в животноводстве и птицеводстве ряда регионов России [2,3].
В связи с этим целью работы явилось изучение антимикробной активности соединения 1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандион-1,5 (нитропроизводного препарата ДАФС-25) на клинические штаммы кишечной палочки.
Материалы и методы. В эксперименте использовали соединение 1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандион-1,5, любезно предоставленное профессором, д.х.н. Б.И. Древко. Эксперимент проводили на 10 токсономически идентичных клинических штаммах Escherichia coli, выделенных от больных с гнойными осложнениями, находящимися на лечении в травматолого-ортопедическом стационаре Саратовского научно-исследовательского института травматологии и ортопедии (СарНИИТО) и обладающих резистентностью к пяти- и более профильным антибиотикам. Суспензию бактерий готовили по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича, путем последовательных разведений до конечной концентрации бактерий – 3·105 клеток в 1 мл. Для изучения антибактериального действия готовили 4 разведения селеноорганического соединения в концентрациях 0,001-1 мг/мл. В качестве растворителя использовали смесь диметилформамида (ДМФА) в 0.9 % растворе NaCl в отношении 1:10. В пробирки с разведениями препарата добавляли по 100 мкл конечной суспензии микроорганизмов и инкубировали в течение 30, 60, 90, 120, 150 мин при комнатной температуре. В качестве контроля использовали такие же количества бактериальной взвеси, разведенные в аналогичных пропорциях с контролем (ДМФА в 0,9 % растворе NaCl), а также выдержанные в течение тех же промежутков времени. После этого бактериальные взвеси из каждой пробирки в количестве 100 мкл высевали на чашки Петри с твердой питательной средой (мясо-пептонный агар), которые затем помещали в термостат на 24 часа при 37 ºС. Подсчет колоний производили на следующий день.
Статистическую обработку полученных данных осуществляли при помощи пакета программ Statistica 6.0. Проверяли гипотезы о виде распределений (критерий Шапиро-Уилкса). Большинство данных не соответствуют закону нормального распределения, поэтому для сравнения значений использовался U-критерий Манна-Уитни, на основании которого рассчитывался Z – критерий Фишера и показатель достоверности p. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали равным 0.05.
Результаты и их обсуждение. Соединение 1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандион-1,5 в концентрациях 0,01-1 мг/мл достоверно подавляло рост клинических штаммов Escherichia coli (E.coli). В концентрации 0,01 мг/мл этот препарат снижал рост клеточных колоний на 39,5 % (30 минут), 50,05 % (60 минут), 64,82 % (90 минут), 79,39 % (120 минут) и на 96,38 % (150 минут) соответственно по сравнению с контролем (р<0,001) (см. таблицу). Более выраженный антибактериальный эффект исследуемое соединение проявляло в концентрации 0,1 мг/мл. При этом число бактериальных колоний уменьшалось по мере увеличения времени инкубации: на 56,34 % (30 минут), 71,58 % (60 минут), 85,08 % (90 минут), 90,87 % (120 минут) и на 92,53 % при инкубации 150 минут по сравнению с контролем (р<0,001).
В максимальной концентрации 1 мг/мл препарат оказывал наибольшее антибактериальное действие. В зависимости от времени инкубации рост бактерий подавлялся на 75,86 % (30 минут), 93,2 % (60 минут), 95,22 (90 минут) и на 99,56 % (120 минут) (р<0,001) соответственно.
Антибактериальное действие соединения 1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандион-1,5 на клинические штаммы E.coli
|
Количество колоний на твердых питательных средах |
||||||
|
Контроль (ДМФА и физ. р-р) |
Опытные группы, концентрация вещества, мг/мл |
|||||
|
1 |
0,1 |
0,01 |
0,001 |
|||
|
Время воздействия, мин |
30 |
1081 (987;1178) |
261(185;278) Zк=3.77; pк=0.000157. |
472(450;570) Zк=3.77; pк=0.000157. |
654(578;843) Zк=3.77; pк=0.000157. |
1020(983;1081) Zк=0.90; pк=0.364347. |
|
60 |
971 (908;1034) |
66(34;264) Zк=3.77; pк=0.000157. |
276(260;320) Zк=3.77; pк=0.000157. |
485(376;773) Zк=3.17; pк=0.001499. |
980(852;1050) Zк=0.11; pк=0.909722. |
|
|
90 |
1046 (848;1155) |
50(9;163) Zк=3.77; pк=0.000157. |
156(94;224) Zк=3.77; pк=0.000157. |
368(241;490) Zк=3.77; pк=0.000157. |
977(790;1093) Zк=1.13; pк=0.256840. |
|
|
120 |
898 (804;1064) |
4(0;10) Zк=3.77; pк=0.000157. |
82(10;89) Zк=3.77; pк=0.000157. |
185(36;217) Zк=3.70; pк=0.000211. |
779(632;885) Zк=1.58; pк=0.112412. |
|
|
150 |
830 (648;905) |
0(0;0) Zк=3.77; pк=0.000157. |
62(27;114) Zк=3.77; pк=0.000157. |
30(19;128) Zк=3.77; pк=0.000157. |
615(504;741) Zк=2.30; pк=0.021135. |
|
Примечания: в каждом случае приведены средняя величина (медиана – Ме), нижний и верхний квартили (25 %;75 %). Zк, pк – различия по сравнению с группой контроля.
При инкубации 150 минут роста бактериальных колоний не наблюдалось (р<0,001). Во всех перечисленных случаях число бактериальных клеток уменьшалось прямо пропорционально увеличению концентрации препарата и увеличению времени инкубации. В низкой концентрации 0,001 мг/мл селеноорганическое соединение достоверно, но незначительно (на 25,9 %) подавляло рост колоний кишечной палочки лишь при максимальной инкубации 150 минут. Сокращение времени инкубации (до 120 минут и менее) не приводило к достоверному изменению числа бактериальных колоний по сравнению с контролем (см. таблицу).
Таким образом, исследованное нами соединение 1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандион-1,5 значительно подавляло рост колоний клинических штаммов кишечной палочки в концентрациях 10-1000 мкг/мл. Особый интерес представляет наличие в структуре препарата 2 двух нитрогпупп, что позволяет проводить аналогию с антибактериальным действием нитрофуранов. Известно, что сами по себе нитрофураны антибактериальной активностью не обладают, но приобретают ее при восстановлении флавинзависимыми редуктазами, т.е. для проявления как терапевтического, так и побочного действия нитрофуранов необходимо их одноэлектронное восстановление ферментами с нитроредуктазной активностью, локализованными в микробах, простейших или тканях организма. Промежуточные продукты последовательных одно- или двухэлектронных этапов восстановления являются высоко реакционноспособными, особенно анион нитрорадикала, благодаря которому нитрофураны приобретают антибактериальную активность [4].
В связи с этим, можно предположить, что, антибактериальная активность соединения 1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандион-1,5 обусловлена наличием в его структуре двух нитрогрупп, которые, подвергаясь действию бактериальных ферментов, проявляют свою цитотоксическую активность в отношении клинических штаммов Escherichia coli.
Вывод. Полученные данные позволяют предполагать перспективность использования соединения 1,5-ди-(м-нитрофенил)-3-селенапентандион-1,5 как антибактериального средства в отношении антибиотикорезистентных штаммов.