Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Процесс старения обусловлен как генетическими, так и факторами окружающей среды, действующими на организм в течение жизни. По одной из теорий в основе старения лежит накопление клеточных нарушений, ослабление механизмов выживания и восстановления клеток и тканей. К молекулярным причинам старения относятся мутации, нарушения процессов репликации и репарации ДНК, гликолиз белков, образование поперечных сшивок между макромолекулами, оксидативный стресс, метилирование ДНК [1]. Морфологическим проявлением последнего, как основного эпигенетического феномена, может быть состояние оптической плотности ядер и диапазон ее изменчивости, обусловленный соотношением конденсации/деконденсация хроматина [8]. Именно с деталями структуры хроматина связаны, большей частью, молекулярные основы тканеспецефической экспресии генов [10]

Поэтому актуальным в условиях современной антропогенной нагрузки становится изучение не только хромосомных абераций, но и особенностей потенциально обратимых изменений структуры хроматина в соматических клетках. Одним из удобных объектов для изучения эпигенетических механизмов регуляции функционирования генома являются интерфазные ядра лимфоцитов периферической крови (ЛПК). Большинство исследований экспрессии генов в лимфоцитах основано на их стимуляции цитокинами и сфокусировано на ограниченном числе специфических генов, контролирующих синтез известных молекул. В то же время глобальное изучение ЛПК у представителей разных возрасных групп, в частности долгожителей, часто выпадает с поля зрения исследователей. Лучшее понимание фундаментальных механизмов старения и факторов долголетия имеет первоочередную значимость для реализации полного потенциала здорового старения [1].

Цель работы – установление цитоденситометрических и ультраструктурных особенностей состояния генома лимфоцитов периферической крови у долгожителей Прикарпатья.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служили лимфоциты периферической крови долгожителей (основная группа, n=284) и людей зрелого возраста (группа сравнения n=218). Группу сравнения составили лица в возрасте от 36 до 60 лет, в родословных которых не было долгожителей.

Забор материала, изготовление микропрепаратов для морфоденситометрии осуществляли по соответствующим методикам [2]. Исследование цитологических препаратов проводили на оптико-электронном комплексе «Метаскан-2». Хроматин ядер и его изменения изучены с помощью полуавтоматической анализатора изображений на базе программного обеспечения Image Tool for Windows (v 3.0). Преимущество данного метода заключается в возможности комбинированной оценки морфометрических (площадь, периметр), спектрометрических (оптическая и интегральная плотность) данных с анализом микроанатомии отдельных хроматиновых блоков и функции хроматина одновременно. Для определения корреляции спектроморфометричних показателей с эпигенетическими эффектами проанализированы индекс хроматизации (ИX) – отношение количества клеток, в ядрах которых преобладал еухроматин, к количеству клеток с преобладанием гетерохроматина, а также индекс морфологически-измененных ядер (МИЯ) – по проценту соответствующих клеток. Все вышеописанные показатели изучены в 100 ядросодержащих эпителиоцитах каждого обследуемого.

Для электронно-микроскопического исследования материал фиксировали, проводили и контрастировали общепринятым методом. Изучение форменных элементов периферической крови проводили на электронном микроскопе ПЭМ-125 К при ускоряющем напряжении 75 кВ с последующим фотографированием при увеличениях от 1200 до 20000 раз.

Результаты исследования и их обсуждение

Изучение цитоденситометричних характеристик лимфоцитов крови является информативным и доступным методом для оценки общего состояния функции и структуры наследственного аппарата организма [4, 5].

Установлены возрастние и половые особенности морфометрических и оптических параметров ядер ЛПК испытуемых (табл.). Так, у всех долгожителей и особенно мужчин зарегистрировано уменьшение периметра ядер лимфоцитов соответственно в 1,15 и 1,16 раза (р<0,05). Закономерно уменьшалась также площадь ядер этих клеток в 1,18 раза у всех долгожителей (в 1,29 раза – у мужчин и в 1,09 раза – у женщин) по сравнению с таковой у людей зрелого и пожилого возраста (р<0, 05).

Существенное снижение площади ядер ЛПК в целом при неизмененной плотности упаковки хроматина в этих ядрах ограничивает пространство внутри ядра для перемещения и/или взаимодействия отдельных локусов хромосом в этом пространстве. Такие ограничения могут быть серьезным препятствием для нормального функционирования генома и процессов его репарации [9].

Полученные результаты о снижении морфометрических показателей ЛПК у долгожителей подтвердили данные других авторов [1] о том, что с возрастом происходит постепенное обезвоживание клеток, тканей. В тоже время в популяции ЛПК встречались клетки, цитоплахма которых содержала крупные вакуоли, окруженные отдельными митохондриями.

Ядро этих ЛПК было заполнено диффузным хроматином, четко определялось перинуклеарное пространство.

Для более объективной оценки функциональной активности генов на этапе транскрипции был проведен детальный анализ топографии интерфазного хроматина. Мы подтвердили данные других авторов о том, что по плотности его можно разделить на четыре компонента: q1 – неактивный гранулярный гетерохроматин (темный компонент), q2 – более активный гетерохроматин (перигранулярний компонент), q3 и q4 – еухроматин (менее и более светлые компоненты соответственно) [6]. При этом нами установлено незначительное уменьшение количества ядер с фракциями еухроматину q3, q4 у долгожителей по сравнению с таковым у людей зрелого возраста, что соотносится с показателями плотности конденсации хроматина в кариоплазме ядер этих индивидов. Вместе с тем выявлены отличия параметра оптической плотности ядер ЛПК в исследуемой группе от группы сравнения. Самые низкие показатели минимальной оптической плотности, особенно за счет q4 еухроматина, выявлены у женщин долгожителей, что коррелировало с диапазоном изменчивости оптической плотности (r=-0,951, (р<0,05). У мужчин долгожителей минимальная оптическая плотность ядер ЛПК незначительно превалировала с таковой в группе сравнения. Показатель максимальной оптической плотности ядер ЛПК у долгожителей преобладал над такой у людей из группы сравнения в 1,13 раза (у женщин – в 1,14 и у мужчин – в 1,11 раза).

Количественный анализ диапазона изменчивости оптической плотности, то-есть нормы реакции степени конденсации хроматина лимфоцитов у долгожителей, показал широкие пределы изменчивости и функциональной неоднородности клеток по сравнению с таковой у людей с зрелого и пожилого возраста. У женщин с основной группы диапазон изменчивости оптической плотности хроматина был больше, чем у мужчин и коррелировал с результатами изучения показателя ИХ (r=0,981, р<0,05). Полученный факт может свидетельствовать о большем диапазон изменчивости популяции лимфоцитов у лиц женского пола. Кроме того, показатель ИХ является одним из важнейших маркеров експрессибельности генома и косвенно коррелирует с количеством дерепресованой ДНК [3]. Изучением особенностей перестройки интерфазного хроматина ЛПК у долгожителей выявлено преимущество ядер с деконденсованным хроматином в противовес такому в группе сравнения в 1,09 раза (см. табл.).

Различные типы клеток человеческого организма содержат одинаковое количество ДНК, хотя экспрессия генов у них разная [4]. Именно изменения хроматина и структуры ядер клеток могут указывать на функциональные нарушения генотипа, обусловленные экзо- и эндогенными факторами, состоянием адаптивных возможностей организма.

Важным критерием оценки наследственного апарата может быть состояние структуры ядер. В случае патологических изменений кариолемы или кариоплазмы изменяется топография хромосом, вероятность присоединения ДНК для деспирализации и последующей транскрипции [7]. Нами получены данные о более частом нарушении нормальной структуры ядер у лиц из группы сравнения чем у долгожителей, соответственно (3,71±0,35) и (4,62±0,41) %. Установлена зависимость количества МИЯ у всех обследованных лиц от пола. Так, у мужчин этот показатель был больше по сравнению с таковым у женщин в 1,15 раза в основной группе соответственно (4,23±0,32) и (3,68±0,36) % и в 1,35 раза в группе сравнения (5,31±0,44) и (3,93±0,38) %. На препаратах исследуемых идентифицировались большие ядра с диффузным хроматином, вакуолизированные, иногда бобовидные или лопатовидные ядра.

Часто ядерная мембрана ЛПК образовывала инвагинации, имевшие вид каналов. Характерным цитологическим признаком влияния негативных экзогенных факторов было образование сегментовиднных ядер ЛПК, появление микроядер [5]. У некоторых людей патологические изменения ядер были настолько глубокими, что приводили к разрушению кариолеммы. Учитывая механизм образования клеток с атипичными ядрами, их, вероятно, можно отвести к показателям цитогенетического действия экзо- и эндогенных факторов.

Таблица

Морфо-денситометрические показатели ядер лимфоцитов периферической крови у долгожителей и группы сравнения, М±m

Примечание. * – достоверность различий с показателями группы сравнения (р<0,05).

Выводы

1. Установлено уменьшение периметра и площади ядер ЛПК у всех долгожителей и особенно мужчин по сравнению с лицами зрелого и пожилого возраста.

2. Доказано увелечение диапазона изменчивости оптической плотности ЛПК у долгожителей, особенно у женщин, более выраженую функциональную неоднородность клеток по сравнению с таковыми у людей с зрелого и пожилого возраста. У долгожителей выявлено преобладание ядер с деконденсованным хроматином и нарушения нормальной структуры ядер по сравнению с таковыми в группе сравнения.