Ключевой задачей генной терапии является создание экспрессионных генетических конструкций, обеспечивающих перенос рекомбинантных генов в целевые клетки ex vivo (in vitro) или in vivo. Рекомбинантные гены могут кодировать различные белки: репортерные – для визуализации процессов генетической модификации клеток и для отслеживания миграции, выживаемости и дифференцировки генетически модифицированных клеток in vivo; терапевтические – различные ферменты, факторы роста и молекулы адгезии, повышающие жизнеспособность клеток, модулирующие тропизм и способность к дифференцировке в определенном направлении. В качестве векторов доставки применяют различные вирусные и невирусные генетические конструкции. Наиболее биобезопасными векторами считают плазмиды – двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК, обладающие малой иммуногенностью и не способные к интеграции в геном клетки-мишени, что определяет их онкологическую безопасность. Однако, несмотря на перечисленные достоинства, плазмидным векторам присущ ряд недостатков, таких как низкая эффективность трансфекции клеток и кратковременная экспрессия трансгенов. Альтернативой плазмидным векторам служат вирусные конструкции. Вирусы представляют собой естественную биологическую систему переноса генов в клетки. Аденовирусы эффективно переносят гены как в делящиеся, так и в покоящиеся клетки, не встраиваются в геном, обеспечивают высокие титры рекомбинантного вируса при продукции и высокий уровень экспрессии трансгенов in vivo и in vitro. К недостаткам аденовирусных векторов относят высокую иммуногенность. Вектора на основе лентивирусов также нашли широкое применение в разработке методов генной терапии. Эти вирусы способны инфицировать различные типы клеток и интегрироваться в геном клеток, тем самым обеспечивая долговременную экспрессию и передачу трансгена при клеточном делении. В то же время интеграция в геном может приводить к инсерционному мутагенезу и риску онкологической трансформации. Таким образом, при разработке генной и генно-клеточных технологий необходимо тщательно подходить к выбору как терапевтических генов, так и генетических векторов для их оптимальной доставки.
Перспективной системой для создания экспрессионных генетических конструкций является система рекомбинации на основе ферментов бактериофага лямбда – GateWay (Invitrogen). Система позволяет с высокой точностью и эффективностью переносить фрагменты ДНК между различными генетическими векторами с помощью сайт-специфичной рекомбинации. Более того, группой американских ученых (Yang et al., 2011) на основе технологии GateWay создана коллекция клонов (hORFeome V8.1), кодирующих более 16100 открытых рамок считывания генов человека, для эффективного субклонирования в различные экспрессионные вектора.
Целью работы является создание генетических конструкций на основе экспрессионных плазмидных, аденовирусных и лентивирусных векторов, кодирующих: различные изоформы сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF121, VEGF165, VEGF189); основной фактор роста фибробластов (FGF2), глиальный нейротрофический фактор (GDNF). В качестве доноров использовали GateWay плазмиды, кодирующие кДНК рекомбинантных генов, полученные в результате TOPO-клонирования продуктов ПЦР-амплификации в плазмиду pENTR, или полученные из некоммерческих банков плазмид (AddGene или DF/HCC DNA Resource Core, Harvard Medical School, США). В качестве векторов назначения использовали лентивирусные конструкции pLX301 и pLX303 (Miller et al., 1993), аденовирусную конструкцию pAd/CMV/V5-Dest (Invitrogen). Получение целевых генетических конструкций подтвердили рестрикционным анализом и секвенированием. Рекомбинантные вирусы получали трансфекцией аденовирусных конструкций pAd в клетки HEK293A или ко-трансфекцией плазмид pLX, упаковочной плазмиды psPAX2 и оболочечной плазмиды pCMV-VSV-G в клетки НЕК293Т. Экспрессию рекомбинантных белков подтвердили флуоресцентными и иммунологическими методами.
Таким образом, получены рекомбинантные плазмидные, аденовирусные и лентивирусные конструкции, экспрессирующие про-ангиогенные, нейротрофические и нейропротекторные факторы (VEGF121, VEGF165, VEGF189, FGF2, GDNF). В дальнейшем полученные генетические конструкции будут использованы в экспериментах in vivo и in vitro для разработки методов генной и генно-клеточной терапии различных дегенеративных заболеваний человека.