Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

При последовательных пересевах дрожжей Saccharomyces cerevisiae краснодарской расы на стандартной питательной среде с увеличивающимися дозами олигосахарида пизамина, природного антивитаминного фактора пантотеновой кислоты (ПК) из проростков гороха [5,7], через семь пассажей приобретали полную устойчивость к концентрации антивитамина в 200 раз большей, чем до адаптации.

Приобретенная устойчивость культуры оказалась наследственно закрепленной. Такие дрожжи при четырехкратном пересеве на стандартной питательной среде, при полном исключении из неё пизамина, полностью сохраняли устойчивость к его ингибирующему действию, даже в самых высоких концентрациях, которые полностью подавляли рост исходных неадаптированных дрожжей. В опытах использова- ли стандартную питательную среду, которая готовилась на дистиллированной воде и в 1 литре объема содержала: MgSO₄∙7H₂O -1 г; (NH4₄)₂SO₄ - 3 г; KH₂PO₄ - 2,5 г; ZnSO₄*7H₂О - 1,0 г; СuSO₄*5H₂O - 0,1 г; FeSO₄ *7H₂O - 0,850 г; тиамин -4,0 мг; пиридоксин - 1,0 мг; инозит - 10,0 мг; Са-пантотенат - 0,5 мг, биотин 2.0 мкг, аспарагин - 1,0 г; сахароза - 20 г. Адаптированные культуры, поддерживаемые длительное время пересевами на сусло-агаре без контакта с пизамином (около 10 лет), также не теряли устойчивости к пизамину, и полностью сохраняли потребность в экзогенном витамине (табл. 1). Их рост отсутствовал при исключении из среды ПК, и они совершенно одинаково стимулировались возрастающими концентрациями ПК, как и неадаптированные исходные, взятые для адаптации. По отношению к различным концентрациям пизамина у них наблюдалась совершенно противоположная реакция. Возрастающие концентрации антивитамина подавляли рост неадаптированных дрожжей, который при 50 и 200 мкг/мл полностью отсутствовал, тогда как у адаптированных, при полном отсутствии подавления роста, наблюдалась даже некоторая стимуляция с возрастанием его концентрации. Особенно это заметно при содержании ПК 0,01 и 0,02 мкг/м. Адаптация дрожжей к антивитаминному действию пизамина не изменила потребность их в экзогенном витамине, она осталась на том же уровне, что и исходных дрожжей. Совершенно аналогичная адаптация наблюдалась и у других видов сахаромицетов.

Таблица 1

Влияние пизамина и дифференцированных доз ПК на рост адаптированных и неадаптированных дрожжей S. Cerevisiae

Высокая устойчивость адаптированных дрожжей к пизамину, и сохранение ими потребности в экзогенном витамине дала возможность использовать такие дрожжи для количественного определения ПК микробиологическим способом, в растительном материале, где присутствовал антивитаминный фактор ПК.

Если считать, что в результате адаптации был получен биохимический мутантный штамм дрожжей, устойчивый к пизамину, с закрепленными генетически новыми свойствами, то такие дрожжи должны обладать свойствами, отличительными от исходной культуры, возможно, не только в устойчивостью к пизамину. Поэтом были изучены физиолого-биохимические свойства адаптированных дрожжей.

Сравнительное изучение динамики роста адаптированных и неадаптированных дрожжей в равных стандартных условиях показало значительное различие их характера и интенсивности роста. Обе дрожжевые культуры выращивали на стандартной питательной среде, интенсивность их роста определяли после 12 часов инкубации и затем через каждые 2 часа в течение 48 часов. Было обнаружено явное сокращение периода лаг-фазы у адаптированных дрожжей. Их рост через 12 часов инкубации, совершенно в равных условиях выращивания, достиг уровня 303 мкг/мл сухого веса, и переходил в экспоненциальную фазу роста, тогда как у неадаптированных рост достигал всего 13 мкг/мл. Экспоненциальная фаза роста у адаптированных дрожжей наступила уже через
12 часов лаг-фазы, опережая контрольные дрожжи на 4 часа, у которых вступление в фазу интенсивного роста наблюдалось только после 16 часов. Однако рост адаптированных дрожжей уже после 20 часов заметно замедлялся и после 24 часов переходил на плато, связанное с обычным явлением истощения питательной среды и общим свойством роста организмов по сигмоидальной кривой.

Было обнаружено, что в клетках адаптированных дрожжей к пизамину происходит накопление значительно больше биологически активных веществ (БАВ), стимулирующих рост дрожжей. Водные экстракты, полученные из адаптированных дрожжей, при добавлении в среду, где ПК была снижена в 2 раза от оптимальной дозы (0,25мг/л), значительно сильнее стимулировали рост дрожжей, чем водные экстракты из неадаптированных. Водные экстракты получали из дрожжей, выращенных на синтетической стандартной питательной среде в течение 48 часов. Полученная масса дрожжей отделялась от питательной среды фильтрованием через бумажный фильтр с вакуумным насосом через воронку Бюхнера, отмывались от питательной среды дистиллированной водой. Такие дрожжи заливали дистиллированной водой по весу 1:2 и экстрагировали в течение 24 часов при температуре 40 ⁰С.

Экстракт из исходных дрожжей практически не оказывал стимулирующего действия, тогда как из адаптированных дрожжей резко усиливал рост, возрастающего с повышением количества вносимого экстракта. Добавление экстракта из адаптированных дрожжей в количестве
10 мкл/мл увеличивало нарастание массы дрожжей почти в 3 раза больше, чем при добавлении такого же количества экстракта из неадаптированных дрожжей, а прибавка прироста экстрактом по сравнению с контролем превышала в 16 раз.

Бродильные свойства адаптированных дрожжей также оказались значительно выше, чем у неадаптированных, Это указывает на то, что вследствие адаптации к пизамину дрожжи становятся физиологически более активными. Причем адаптированная культура, использованная для проведения этих опытов, поддерживаемая пересевами на сусло-агаре без контакта с пизамином до 10 лет, давала совершенно аналогичный результат.

Таким образом, в результате адаптации дрожжей у них наблюдается изменение физиолого-биохимических процессов, приводящих к образованию стимулирующих рост веществ. Это могут быть либо вещества, образуемые de novo, либо имеющиеся в нормальном метаболизме исходной культуры, но образуемых в бόльших количествах при адаптации.

Без добавления экстрактов в присутствии 10 мкг/мл пизамина рост дрожжей полностью отсутствовал. Внесение в среду 2,5 мкл/мл экстракта из адаптированных дрожжей полностью инактивировало тормозящее действие пизамина. Рост дрожжей не только восстанавливался, но и был выше контрольного варианта. Экстракт же из исходных дрожжей, выращенных при тех же условиях, подобный эффект давал только при 10 мкл/мл, т.е. в 4,5 раза большей концентрации, а при 7,5 мкл/мл рост дрожжей достигал только уровня на контрольной среде без ингибитора. Здесь, как и в предыдущих исследованиях, экстракт из адаптированных дрожжей был 2,2 - 2,4 раза выше в стимулировании дрожжей во всех концентрациях, кроме концентрации 2,5 мкл/мл, при которой рост дрожжей при добавлении экстракта из неадаптированных дрожжей был в 11 раз ниже, так как проявлялось тормозящее действие пизамина. Точно такая же зависимость роста дрожжей была получена в опытах с применением различных концентраций пизамина и экстрактов.

Таким образом, дрожжи как адаптированные, так и неадаптированные, содержат какой-то фактор или факторы, специфически инактивирующие антивитаминное действие пизамина и также способствуют активации роста дрожжей. Причем эти факторы у адаптированных дрожжей либо активнее, либо накапливаются в бόльших количествах. Определить их можно только при выделение и идентификации. Оказалось что в экстрактах как адаптированных, так и неадаптированных дрожжей на гистограмме присутствует два активных фактора, инактивирующих биологическое действие пизамина и стимулирующих рост дрожжей с Rf-0,6 и Rf-0,85. Причем вещество с Rf-0,85 значительно активнее, чем вещество с Rf-0,6 , хотя по содержанию его в экстракте меньше. Особенно важно отметить, что оба вещества адаптированных дрожжей, накапливаются в бόльших количествах, о чем свидетельствует более широкая зона на гистограмме инактивации пизамина, отмеченная и уровнем стимуляции роста дрожжей. Этим методом одно из этих веществ с Rf-0,6 было идентифицировано и оказалось трипептидом - глутатионом, что полностью совпадает с расположением маркера этого вещества на гистограмме. В проведенных нами опытах глутатион устранял антивитаминное действие пизамина [6]. Как известно, глутатион является основным естественным антиоксидантом, синтезируемый дрожжами, защищающим клетки от окислительного стресса. Другое вещество нам, к сожалению, идентифицировать не удалось. Инактивация пизамина глутатионом вполне обоснована. Как известно в клетках Rhodobakter capsulatus обнаружен комплекс глутатион-глутаредоксин, как часть комплексной регуляторной сети, контролирующей противоокислительную защиту процесса [9]. Система глутатион-глутаредоксин участвует в защите клетки от окислительного стресса.

Общеизвестно, что любые адаптивные изменения живых организмов к различным стрессовым воздействиям неблагоприятных факторов среды, как правило, связано с образованием адаптивных белков [1]. В связи с этим возник интерес изучить возможную связь функ- ционально-биохимических изменений дрожжей с белковым обменом. В связи с этим были проведены опыты по изучению влияния пизамина на накопление общего белка в дрожжевых клетках до, и после адаптации к пизамину. Дрожжи выращивали в колбах с объемом питательной среды 200 мл, что давало возможность получения большой массы дрожжей на различных, в основном высоких, концентрациях пизамина, в которых после завершения роста определяли количественное содержание белка.

У отмытых, после прекращения роста дрожжей каждого варианта, определяли содержание белка по Лоури [10] и рассчитывали на грамм сухого веса дрожжей. Также определяли и накопление сухой массы дрожжей, и содержание белка в сухой массе дрожжей в среднем на колбу.

Результаты видны в табл. 2. Дрожжи после периода торможения на среде с пизамином, возобновив рост и подвергаясь пролонгируемому действию пизамина, повышали нарастание сухой массы соответственно повышению концентрации пизамина. Однако, если нарастание массы дрожжей возрастало с повышением концентрации пизамина, то накопление белка на единицу веса дрожжей было связано только с присутствием пизамина и не зависело от количественного содержания его в среде. Такой результат, несомненно, позволяет сделать заключение, что пизамин, вызывает повышение синтеза дрожжевыми клетками белка, которое связано только с его присутствием, как фактора стресса, вызывающего подавление роста дрожжей и не зависит от количественного содержания. Подобное действие пизамина проявляется только на дрожжах, нуждающихся в экзогенной ПК и чувствительных к ингибитору. Ни усиления роста, ни повышения содержания белка в клетках дрожжей Сandida utilis, не чувствительных к пизамину и ауксоавтотрофных в отношении ПК, не наблюдалось.

Таблица 2

Влияние пизамина на накопление биомассы дрожжей и белка в дрожжевых клетках S. cerevisiae*

*Рост дрожжей в контроле завершался на 2-е сутки, в присутствии пизамина после 5-ти суток задержки, завершался на 6-7-е сутки

Повышенный синтез белка у адаптированных дрожжей сохранялся как постоянное свойство и не изменяется в присутствии пизамина, так как запущенная программа синтеза белка на биохимический стресс уже реализована. Из результатов представленных в таблице 3 видно, что неадаптированные дрожжи после периода торможения роста повышали синтез и накопление белка в клетках до 32,68 мг/г сухого веса, тогда как в контроле содержание белка было на уровне 25,08 мг/г, т.е. на 30,3 % больше. Адаптированные дрожжи как на среде без пизамина, так и в его присутствии (100 мкг/мл), содержали совершенно одинаковое количество белка как в контроле (32,34 мг/г ), так и в опыте (32,19 мг/г сухого веса ). На наш взгляд это весьма интересен факт, что содержание белка у адаптированных дрожжей было адекватно содержанию его у дрожжей не адаптированных, но выросших при пролонгированном инкубационном периоде в присутствии 100 мкг/мл пизамина (табл. 3).

Изменение белковообразовательной функции у дрожжей под действием пизамина указывает на глубокие изменения в обмене веществ, которые могут быть следствием белковосинтетической функции, которая закрепляется у них наследственно.

Таблица 3

Влияние пролонгирующего действия пизамина на накопление белка у адаптированных
и неадаптированных к нему дрожжей

Усиление белкового синтеза на различные воздействия физических и химических факторов среды, является общебиологическим свойством для всех живых организмов [2,3,8]. В многообразии реакции живых организмов на разные типы стрессовых воздействий выявляется значительная качественная аналогия. Это связано с тем, что в процессе эволюции сформировались различные генетические системы, обеспечивающие гомеостатические свойства. Образование различных белков, различаются, в основном, по эффективности и времени, необходимого для развертывания полной программы [1,4]. Адаптация к тем или иным стрессовым ситуациям основана на индуцировании синтеза специфических, адекватным характеру стрессовых условий, белков. Не исключена возможность наличия не одной, а нескольких адаптивных генетических систем, ответственных за устойчивость. Каждая из них экспрессируется через один и тот же механизм - индуцированный синтез белка.

Механизм мутационных путей, индуцируемых в ответ на изменение среды, приводящих к ответным реакциям через стрессы, индуцируют генетические изменения, что и видно при адаптации дрожжей к пизамину, как химическому стрессору.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Удовенко Г.В. Механизм адаптации растений к стрессам // Физиология и биохимия культурных растений.- 1979. - Т. 11.- вып. 2.- С. 99-107.

2. Блехман Г.И. Синтез белка в условиях стресса // Успехи современной биологии. -1987.- т.103.-вып. 3.- с.340-353.

3. Гудкова Н.В.,. Касаковская И.В., Майор П.С. Синтез стрессовых белков в проростках пшеницы под действием гаммарадиации // Доп. НАН України.-2001.-№2-с.171-179.

4. Касакiвська ĺ.В., Голов′яненко ĺ.В. Роль бiлкiв теплового шоку в адаптации рослин до стрессiв // Физиология. и биохимия культурных растений. -2007.- т.39 .- №3.-с.187-199.

5. Смашевский, Н.Д. Механизм адаптации дрожжей к пизамину // Ученые записки (серия химико-биологическая) т.XIII. Хабаровский государственный педагогический институт. Хабаровск.1968. С. 5 -11.

6. Смашевский, Н.Д. Инактивация глутатитоном пизамина антивитамина пантотеновой кислоты из проростков гороха. // Материалы междун. научно-практич. конференции, посвященной 75 летию Астраханского государственного университета 20-25 августа 2007 г. Экология биосферы: Проблемы изучения, индикации и прогнозирования. Часть 2. - Издательский дом «Астраханский университет». 2007 г. С .222-224.

7. Смашевский Н.Д. Природный антивитамин пантотеновой кислоты в высшем растении, его физиологическая роль и механизм действия. // Материалы XVII международного симпозиума «Нетрадиционное растениеводство, Селекция. Охрана природы. Эниология. Экология и здоровье» 13-21 сентября 2008 года, г. Алушта. Симферополь - 2008. -с.531-537.

8. Смашевский Н.Д. Антивитаминное действием олигосахарида пизамина из проростков гороха // Фундаментальные исследования.-2009.-№3.-с. 24-27.

9. Kirshner M., Winkekhaus S., Theifelder J., Nover L. Transient expression and heat-stress-induced co-aggregation of endogenous and heterologous small heat-stress proteins in tobacco protoplasts // Plant J.-2000.-24, N 3.-P. 397-411.

10. Li Kuanyn. Hein Silke, Zou Wenxin, Klug Gabiell. The glutation-gluta-redoxin sistem in Rhodobacter Capsulatus: Part of a complex against oxidative stress // Bacteriol.-2004. - V. 186. - № 20.- P. 6806-6808.

11. Lowry O.H., A.L Rosebrough, R.J Farr Randall. Protein measurement with the Folin phenol reagent //J. Biol. Chem.- 1951.- V. 193. -
P. 265-275