Учитывая идентичность спектральных изменений, сопровождающих нагревание водных растворов ДНК [1, 2] и их насыщение кислородом [4, 6, 7], мы предположили, что тепловой гиперхромизм ДНК зависит от содержания кислорода в ее растворах.
Цель исследования. Целью настоящего исследования была экспериментальная проверка такого предположения.
Материалы и методы исследования
В работе использовали растворы ДНК, приготовленные на 50 мМ Na-какодилатном буфере, pH 6,9 [2].
Для дегазации, растворы ДНК (20 °С) в течение 1 часа выдерживали в вакуумном эксикаторе под давлением ~ 13 мм рт. ст.
Насыщение растворов ДНК (20 °С) кислородом осуществляли барботированием (кислородом) [6, 7].
В работе использовали ДНК из тимуса теленка (Serwa, Германия).
Тепловое плавление ДНК проводили в соответствии с [9].
Тепловой гиперхромизм растворов ДНК, наблюдаемый при их нагревании от 20 до 95 °С, рассчитывали по формуле:
h(%) = [A260 (95 °С) − A260 (20 °С) / A260 (20 °С)] ·100 %.
Для регистрации УФ-спектров поглощения растворов ДНК использовали спектрофотометр Specord UV VIS (Carl Zeiss Jena, Германия).
Результаты исследования и их обсуждение
Установлено, что нагревание дегазированных растворов ДНК от 20 до 95 °С не приводит к изменениям их спектров поглощения в диапазоне длин волн: 220 – 300 нм (рис. 1А). Также установлено, что нагревание растворов ДНК, насыщенных кислородом, от 20 до 95 °С сопровождается их гиперхромизмом в диапазоне длин волн: 220 – 300 нм (рис. 1Б), который может превышать 100 %.
Обсуждение результатов. Полученные результаты (рис. 1) показывают, что тепловой гиперхромизм ДНК наблюдается только для ее кислородсодержащих растворов. Учитывая положения теории гипохромии олиго- и полинуклеотидов [5], полученные результаты означают, что термическая денатурация ДНК происходит только в кислородсодержащих растворах (рис. 1Б), а в бескислородных растворах ДНК термически резистентна (рис. 1А).
Результат, представленный на рис. 1Б, позволяет предположить, что тепловой гиперхромизм ДНК отражает процесс её модификации синглетным кислородом или другими АФК, образующимися при нагревании [3, 4, 6-8]. Так, модификация синглетным кислородом, которая сопровождается одноэлектронным окислением ДНК [8], может приводить к дегидрированию её оснований и, как следствие, к потере лабильных атомов водорода, участвующих в образовании водородных связей между комплементарными цепями ДНК, т.е. – к тепловому плавлению ДНК.
Очевидным практическим приложением обнаруженной зависимости (рис. 1) является дифференциальная УФ-спектроскопия ДНК [2], используемая для определения её структуры [10]. Учитывая способ получения термических дифференциальных спектров (ТДС) ДНК [10], на основании полученных результатов можно утверждать, что их вид будет зависеть от содержания кислорода в растворах исследуемой ДНК. Например, ТДС дегазированного раствора ДНК, полученный вычитанием спектра 1 из спектра 2 (рис. 1А), практически совпадёт с осью абсцисс, т.е. – будет совершенно не информативен.
А – УФ-спектры поглощения дегазированного раствора ДНК: 1 – при 20 °C; 2 – при 95 °C; Б – УФ-спектры поглощения раствора ДНК, предварительно, в течение 15 мин., барботированного кислородом: 1 – при 20 °C; 2 – при 95 °C
Выводы
Тепловой УФ-гиперхромизм ДНК наблюдается только для ее кислородсодержащих растворов.
В бескислородных растворах ДНК термически резистентна.