Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Проблема инфекционно-воспалительных заболеваний урогенитального тракта является стратегически важной задачей сохранения репродуктивного здоровья нации. На фоне снижения роста инфекций, передаваемых половым путем (ИППП), наблюдается увеличение частоты воспалительных заболеваний, протекающих с нарушениями урогенитального микробиоценоза, которые отмечаются у 60,0 – 65,0 % обследованных [1, 6, 7, 11, 12, 13]. Воспалительный процесс нижнего отдела урогенитального тракта, пусковым механизмом которого может служить активизация условно-патогенной микрофлоры, нередко имеет торпидное, бессимптомное течение, увеличивает риск развития воспалительных заболеваний органов малого таза (ВЗОМТ), осложнений беременности, родов, вызывает дискомфорт, снижение качества жизни [2, 3, 5, 8, 10, 11, 18, 20].

У половых партнеров пациенток с хроническими урогенитальными воспалительными заболеваниями, обусловленными условно-патогенной микрофлорой, часто встречаются простатиты, эректильная дисфункция, фертильность [6, 15]. При этом стертые формы заболевания урогенитального тракта регистрируются в два раза чаще, чем клиническая манифестация. Клинико-лабораторные признаки уретрита сопровождаются выделением условно-патогенных микроорганизмов в диагностических титрах в три раза чаще, чем облигатных патогенов [14]. При этом условно-патогенные микроорганизмы зачастую выявляются не одновременно, а последовательно, один за другим в процессе этиотропной терапии ИППП, особенно при рецидивирующем характере течения заболевания [4].

Матричная лазерная десорбционная времяпролетная масс-спектрометрия (MALDI-TOF-MS) – метод идентификации молекул путем измерения отношения их массы к заряду в ионизированном состоянии. Ионизация вещества происходит с помощью матрицы и лазерного излучения, масса молекулы оценивается по времени пролета от источника ионизации до детектора. Возможность регистрации белковых масс-спектров, уникальных и воспроизводимых для семейств, родов, видов и подвидов микроорганизмов, формирует основу для применения масс-спектрометрии для идентификации и типирования микробов. В связи с этим представляет научно-практический интерес внедрение инновационных технологий в микробиологическую диагностику с возможностью видовой идентификации условно-патогенных микроорганизмов методом прямого масс-спектрометрического профилирования рибосомальных белков
[9, 16, 17].

Цель исследования. Масс-спектрометрическое профилирование бактерий и оценка возможности его применения для видовой идентификации микроорганизмов у пациентов с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта.

Материалы
и методы исследования

Проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 681 пациента в возрасте от 18 до 45 лет (средний возраст 34,2±0,5 года), являющихся половыми партнерами пациенток с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта, обусловленными условно-патогенными микроорганизмами, и обратившихся на консультативный прием в ФГБУ «Уральский НИИ дерматовенерологии и иммунопатологии» Минздрава России с предварительным диагнозом неспецифический уретрит (N34.1). Анализ клинико-анамнестических данных, лабораторных и инструментальных исследований показал наличие осложнений в виде простатита у 166 (24,4 %), эпидидимита – у 8 (1,2 %), орхита – у 5 (0,7 %) пациентов.

Критерии включения: Возраст 18-45 лет; письменное информированное согласие на участие в исследовании; наличие диагноза НГУ, подтвержденного микроскопическим и микробиологическим методами. Критерии исключения: наличие ИППП (положительные результаты лабораторных тестов на наличие N. gonorrhoeae, C. trachomatis, T. vaginalis, M.genitalium, вируса простого герпеса (HSV), вируса папилломы человека (HPV), антибактериальная терапия в предшествующие 3 месяца. Оформление медицинской документации включало наличие информированного согласия пациента на проведение диагностических и лечебных манипуляций. Взятие отделяемого уретры производилось одноразовым стерильным урогенитальным зондом и помещалось в пробирку с транспортной средой Amies (Италия). Подготовка материала для оценки урогенитальной микрофлоры выполнялась в соответствии с приказом МЗ СССР № 535 от 22.04.1985 г. «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений». Идентификация микроорганизмов проводилась методом времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI TOF MS) с помощью анализатора микроорганизмов BioMerieux VITEK MS MALDI-TOF (Регистрационное удостоверение № ФСЗ 2012/12091 от 05.05.2012. Срок действия: не ограничен). Экстракция белков осуществлялась на одноразовом слайде с использованием готового матрикса для VITEK MS. Интерпретация результатов проводилась с использованием базы данных VITEK MS, состоящей из клинически значимых видов и расширенного классификатора спектров. Диагностика хламидий, урогенитальных микоплазм, вируса простого герпеса, цитомегаловируса, вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска осуществлялась методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием наборов реагентов «АмплиСенс C.trachomatis /Ureaplasma /M.genitalium/M.hominis Мультипрайм-FL», «АмплиСенс HSV/CMV- Мультипрайм-FL». «АмплиСенс ВПЧ ВКР скрин-титр-FL» (ЦНИЭ, Москва).

Результаты исследования
и их обсуждение

У 96,4 % пациентов с уретритом, с исключенными возбудителями ИППП, были выделены условно-патогенные микроорганизмы, в 68,6 % случаев – в диагностическом титре 104, в 31,4 % – в титре 107-109. Частота выявления условно-патогенных микроорганизмов в диагностически значимых титрах (104–109) в уретральном отделяемом пациентов с НГУ представлена
в табл. 1.

Таблица 1 

Частота выявления условно-патогенных микроорганизмов в уретральном микробиоценозе мужчин с уретритами (n=681) *

* – поливариантный признак; ** – жирным шрифтом отмечены условно-патогенные микроорганизмы, видовая идентификация которых проведена масс-спектрометрическим методом (при бактериологическом исследовании возможна только идентификация до рода).

При исследовании микробного спектра урогенитального тракта больных с уретритом наиболее часто из условно-патогенных микроорганизмов выделялись грамположительные, факультативно-анаэробные микроорганизмы рода Staphylococcus (74,4 %), Streptococcus (52,7 %), Enterococcus (15,7 %), микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae (11,5 %) в умеренных и высоких диагностических титрах. Применение высокотехнологичного метода масс-спектрометрии позволило расширить представления о видовой идентификации условно-патогенных микроорганизмов, увеличить спектр видовой идентификации условно-патогенной микрофлоры на 43,5 %. Количество видов представителей рода Streptococcus, Staphylococcus, Corynebacterium, неферментирующих грамотрицательных палочек с применением MALDI TOF MS в 2,2 раза превышает возможности бактериологического исследования.

Все пациенты с неспецифическим уретритом были разделены на 2 группы: 438 (64,3 %) пациентов, средний возраст 34,3±0,7 года, с длительностью заболевания – до 2 месяцев (острый процесс), 67,6 % предъявляли жалобы. Вторая группа – 243 (35,7 %) пациента с хроническим процессом (длительность заболевания свыше 2 месяцев), средний возраст 37,5±0,8 лет, 69,5 % с жалобами. Субъективные симптомы (зуд, жжение, дискомфорт) предъявляли 225 (51,4 %) мужчин с острым процессом, в 2,8 раза чаще по сравнению с пациентами с хроническим процессом – 50 (20,6 %). Пациенты с острым и хроническим уретритом одинаково часто предъявляли жалобы на выделения из уретры 18,3 % и 15,2 % соответственно. Объективные симптомы воспаления наблюдались у 268 (61,2 %) мужчин с острым процессом и у 151 (62,1 %) пациента с хроническим заболеванием уретры. Гиперемия губок уретры чаще отмечалась у пациентов с острым процессом (44,7 %) по сравнению с больными с хроническим уретритом (33,9 %), р≤0,05. С одинаковой частотой регистрировались отечность (43,3 % и 36,3 %), высыпания (26,8 % и 31,8 %) и налет (23,6 % и 29,8 %) в сравниваемых группах. При отсутствии жалоб со стороны урогенитального тракта, объективные симптомы отмечались у 36,7 % пациентов с острым, и в 2 раза чаще – 61,6 % с хроническим процессом, р≤0,001. Бактериоскопическое исследование отделяемого уретры выявило повышенное количество полиморфноядерных лейкоцитов у пациентов с острым уретритом – 171 (38,8 %), по сравнению с больными с хроническим процессом – 58 (23,7 %) (р≤0,05).

Анализ результатов масс-спектрометрических исследований клинического материала показал, что у пациентов с острым уретритом достоверно чаще выявлялись Str. mitis (7,8 %) по сравнению с больными с хроническим процессом (4,5 %), р≤0,05. Доминирующий в микробиоценозе уретры St. epidermidis достоверно чаще выявлялся у пациентов с хроническим заболеванием (49,8 %), чем с острым (39,9 %), р≤0,001.

Достоверно чаще у пациентов с острым уретритом, предъявляющих жалобы (n=296) по сравнению с пациентами без субъективных симптомов выявлялись представители рода Streptococcus (42,6 %), из которых 22,6 % – Str.anginosus, S.epidermidis (43,9 %), Ureaplasma (13,5 %), ассоциации из 2 – 5 сочленов микробиоценоза (63,9 % и 53,5 % соответственно), р≤0,05. Только у пациентов с острым уретритом, предъявляющих жалобы, были диагностированы Klebs. pneumoniae (1,7 %), Proteus mirabilis (0,7 %), Acinetobacter (3,4 %), Pseudomonas (0,7 %). При этом значительно реже регистрировались моноинфекции – 33,1 % по сравнению с группой пациентов с острым уретритом без субъективных симптомов,42,3 %, р≤0,05. В группе пациентов с хроническим процессом, предъявляющих жалобы (n=169), наблюдалась подобная тенденция. Достоверно чаще выявлялись стрептококки (46,7 %), из которых 23,7 % – Str.anginosus, p<0,05, S.epidermidis (56,2 %), р≤0,001, ассоциации из 2 – 5 условно-патогенных микроорганизмов (66,3 % и 51,4 %), р≤0,05. При этом значительно реже регистрировались моноинфекции – 31,9 % против 43,2 %, р≤0,05. Частота выявления условно-патогенных микроорганизмов у групп пациентов с острым и хроническим уретритом представлена в табл. 2.

Сравнительный анализ микробного спектра клинического материала из уретры больных с субъективными симптомами показал более высокую встречаемость при остром уретрите Str.mitis (8,1 %), Ureaplasma spp. (13,5 %) по сравнению с хроническим процессом, р≤0,05. При хроническом уретрите достоверно чаще регистрировался S.epidermidis (56,2 % ), р≤0,01.

Важным в эпидемиологическом отношении является факт обнаружения условно-патогенных микроорганизмов в диагностических титрах у больных с уретритами без субъективных симптомов воспаления. При остром уретрите достоверно чаще диагностировался Enterococcus faecalis (21,2 %), р≤0,05, при хроническом процессе – Str.anginosus (25,7 %), представители семейства Enterobacteriaceae (16,2 %) E.coli (10,8 %), р≤0,05. Анализ ассоциаций условно-патогенных микроорганизмов у больных острым и хроническим уретритом показал, что доминирующим по частоте выявления сочетанием является Str.anginosus и S.epidermidis (21,3 % и 21,7 %, соответственно). По данным литературы, Str.anginosus характеризуется инвазивными свойствами, обусловливающими диссеминированные гнойные заболевания. В связи с недостаточной возможностью идентификации Str.anginosus обычными бактериологическими методами, сведения о распространенности ограничены [19].

Проведенный анализ показал, что встречаемость микробных ассоциаций из 4-5 условно-патогенных агентов, включая Str.anginosus и S.epidermidis, превышала в 6,3 раза при хроническом процессе (70,2 %) по сравнению с острым течением уретрита (11,1 %), р≤0,001. Ассоциация Str.anginosus и S.epidermidis у больных с острым и хроническим уретритом, предъявляющих жалобы выявлялась в 12,1 %-15,4 % случаев, у пациентов без субъективных симптомов в 7,7 %-8,1 % случаев. Отмечено значительное превалирование частоты выявления микробной ассоциации Str.anginosus и S.epidermidis (инфекционный индекс 2) у больных хроническим (20,5 %) и острым (19,4 %) уретритом, предъявляющих жалобы, по сравнению с пациентами без жалоб (3,7 % и 10,3 %), р≤0,01.

Таблица 2

Частота выявления условно-патогенных микроорганизмов у пациентов с острым и хроническим уретритом (n=681)

Примечание. * – различия между подгруппами пациентов с жалобами и без жалоб в группе больных острым НГУ, р≤0,05;

** – различия между подгруппами пациентов с жалобами и без жалоб в группе больных хроническим НГУ, р≤0,05;

*** – различия между подгруппами пациентов без жалоб с острым и хроническим НГУ, р≤0,05;

**** – различия между подгруппами пациентов с жалобами с острым и хроническим НГУ, р≤0,05.

Заключение

Таким образом, комплексное клинико-лабораторное обследование пациентов с негонококковыми уретритами, с использованием инновационной микробиологической технологии масс-спектрометрии, позволило установить частоту встречаемости, расширить представления о видовом разнообразии условно-патогенной микрофлоры, провести количественную оценку (диагностически значимые титры), установить превалирующие ассоциативные связи условно-патогенных микроорганизмов урогенитального микробиоценоза. Спектр идентифицируемых видов Streptococcus, Staphylococcus, Corynebacterium, неферментирующих грамотрицательных палочек, с применением высокотехнологичного метода MALDI TOF MS, увеличен в 2,2 раза по сравнению с классическим бактериологическим исследованием. Встречаемость микробных ассоциаций из 4-5 условно-патогенных агентов, включая Str.anginosus и S.epidermidis, превышала в 6,3 раза при хроническом процессе (70,2 %) по сравнению с острым течением уретрита (11,1 %), p<0,001. Увеличение частоты инфекционных заболеваний, протекающих на фоне нарушений урогенитального микробиоценоза с участием условно-патогенной микрофлоры, диктует перспективное изучение устойчивых сочетаний микроорганизмов, сопутствующих хронизации инфекционно-воспалительных заболеваний урогенитального тракта, зачастую с бессимптомной клинической картине, что негативно влияет на репродуктивное здоровье.