Переломы длинных трубчатых костей сопровождаются общими и местными изменениями. Посредством нейрогуморальных механизмов в организме включаются адаптационные и компенсаторные системы, направленные на выравнивание гомеостаза и восстановление поврежденной костной ткани. Оптимальные условия для репаративной регенерации создаются в условиях неподвижности костных отломков. При несоблюдении этих условий возникающий диастаз заполняется волокнистой соединительной тканью, постепенно превращающейся в фиброзную ткань, а при выраженной подвижности отломков образуется также хрящевая ткань и формируется ложный сустав [3].
Иммунная система оказывает несомненное влияние на характер репаративных процессов в поврежденной зоне [1]. Важными факторами регуляции остеогенеза являются лимфоциты, моноциты-макрофаги, нейтрофилы [2]. В метаболизме костной ткани активное участие принимают остеокласты с локальной продукцией цитокинов [7].
Цель исследования – изучить особенности иммунного статуса пациентов с замедленной консолидацией костной ткани через 7 – 18 месяцев после закрытой травмы длинных трубчатых костей.
Материалы и методы исследования
Обследовано 39 пациентов через 7 – 18 месяцев после закрытых переломов длинных трубчатых костей, которые были разделены на две группы: основную и контрольную. Основная группа включала 19 пациентов в возрасте 41,8±3,4 лет, поступивших на лечение с последствиями закрытых переломов верхних и нижних конечностей (бедра – 9, голени – 8, плеча – 2): 10 мужчин и 9 женщин. Из них 8 пациентов до поступления лечились с использованием внутренней фиксации (накостный остеосинтез – 5 больных, интрамедуллярный блокируемый стержень – 3 больных), а 11 – с применением внешнего остеосинтеза. Причины нарушений консолидации были следующими: при внешней фиксации – неправильно выбранная схема остеосинтеза, отсутствие точной репозиции и раннее снятие аппарата. При использовании накостного остеосинтеза в двух случаях отмечали неправильный выбор типа или размера металлофиксатора, что не создавало прочной фиксации, в трех – перелом пластины или винтов. С блокируемым интрамедуллярным стержнем поступило на лечение трое больных с тяжелыми оскольчатыми переломами, в результате чего даже в условиях стабильной фиксации осколки не были адаптированы к своему ложу, вследствие чего формировался краевой дефект и сохранялся диастаз между основными фрагментами. В контрольной группе использованы иммунологические показатели 20 пациентов аналогичного возраста с закрытыми переломами верхних и нижних конечностей, пролеченных в РНЦ ВТО по разработанным методикам с соблюдением всех методических принципов чрескостного остеосинтеза, у которых в обычные сроки было достигнуто сращение костных отломков в правильном положении. В исследование не включались пациенты с сопутствующей соматической патологией, способной повлиять на результаты иммунологического исследования.
Типирование лимфоцитов периферической крови осуществлялось методом лазерной проточной цитометрии на цитометре «BECKMAN COULTER EPICS XL» (США) с помощью двух, трёх, четырехцветных моноклональных антител компании «Immunotech» (Франция). Количественное определение иммуноглобулинов классов и цитокинов осуществлялось методом ИФА на иммуноферментном анализаторе BIO-TEK Instruments Inc, ELx808 (CША) с использованием набора реагентов ЗАО «Вектор-Бест» (Россия). Определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) проводилось методом преципитации 3,5 % ПЭГ (ММ 6000). На проведение клинических исследований получено разрешение комитета по этике ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова Минздрава».
Анализ результатов исследования проводили с помощью программного обеспечения AtteStat, выполненного как надстройка к «Microsoft Exсel» программного продукта «Microsoft Office». Полученные данные обрабатывались с помощью методов непараметрической статистики с использованием U – критериев Вилкоксона, Манна – Уитни. Результаты исследования представлены в виде медиан и интерквартильных размахов (25 и 75 процентили). Для оценки корреляции применялся ранговый критерий Спирмена.
Результаты исследования и их обсуждение
В отдаленные сроки после закрытой травмы длинных трубчатых костей показатели лейкограммы (лейкоциты, лимфоциты), независимо от результата хирургического лечения, находились в пределах значений физиологической нормы и не имели статистически значимых отличий (табл. 1).
Таблица 1
Показатели лейкограммы у пациентов со сросшимися переломами и несовершенным остеогенезом в сроки от 1,5 до 2 лет после травмы
Показатель |
Замедленна консолидация костной ткани |
Сращение перелома в сроки |
Лейкоциты (109/л) |
6,7 (5,9 - 8,3) |
6,1 (4,9 - 7,3) |
Лимфоциты ( %) |
35,0 (26,5 - 38,0) |
31,0 (26,0 - 37,3) |
Лимфоциты (109/л) |
2,2 (1,9 - 2,5) |
1,83 (1,53 - 2,12) |
Моноциты ( %) |
9,0 (8,0 - 10,0) |
9,0 (7,8 - 10,0) |
Моноциты (109/л) |
0,64* (0,53 - 0,72) |
0,52 (0,45 - 0,67) |
Примечание. * - р≤0.05 в сравнении с показателями пациентов у которых сращение было достигнуто в срок.
При этом абсолютное количество моноцитов в группе с нарушенным остеогенезом было достоверно выше, чем в группе с отсутствием послеоперационных осложнений. Соотношение CD4 к CD8 было выше в группе с нарушенным остеогенезом в связи с повышением в этой группе количества Т-хелперов и снижением числа цитотоксических Т-лимфоцитов по сравнению с показателями, зарегистрированными при нормальном течении рапаративных процессов в костной ткани (табл. 2).
Таблица 2
Показатели клеточного иммунитета у пациентов со сросшимися переломами и несовершенным остеогенезом в сроки от 1,5 до 2 лет после травмы
Показатель |
Замедленна консолидация костной ткани |
Сращение перелома в сроки |
СD3+СD19- ( %) |
74,8 (70,5 - 81,0) |
79,7 (73,6 - 81,8) |
СD3+СD19- (109/л) |
1,7 (1,4 - 1,98) |
1,5 (1,21 -1,73) |
СD3+СD4+ ( %) |
49,4* (44,6 - 54,0) |
44,6 (41,7 - 50,8) |
СD3+СD4+ (109/л) |
1,1* (0,9 - 1,3) |
0,8 (0,7 - 1,1) |
СD3+СD8+ ( %) |
26,1* (22,0 - 28,5) |
28,9 (27,1 - 36,5) |
СD3+СD8+ (109/л) |
0,6 (0,46 - 0,66) |
0,53 (0,45 - 0,71) |
СD3-СD16+СD56+ ( %) |
11,3 (8,4 - 14,0) |
10,3 (6,7 - 12,4) |
СD3-СD16+СD56+ (109/л) |
0,27* (0,18 - 0,31) |
0,16 (0,13 - 0,24) |
СD3+СD16+СD56+ ( %) |
3,8 (3,1 - 6,6) |
5,5 (4,7 - 8,4) |
СD3+СD16+СD56+ (109/л) |
0,07 (0,05 - 0,1) |
0,11 (0,08 - 0,13) |
СD3-СD19+ ( %) |
10,0 (8,1 - 13,2) |
9,1 (7,1 - 11,4) |
СD3-СD19+ (109/л) |
0,23* (0,18 - 0,33) |
0,16 (0,14 - 0,23) |
СD3+HLA-DR (109/л) |
4,7* (3,5 - 7,0) |
3,7 (2,7 - 4,1) |
СD3+HLA-DR ( %) |
0,11* (0,07 - 0,15) |
0,07 (0,04 - 0,08) |
СD3+СD25+ ( %) |
3,5 (3,15 - 4,9) |
2,9 (2,7 - 3,8) |
СD3+СD25+ (109/л) |
0,08* (0,06 - 0,12) |
0,06 (0,05 - 0,08) |
СD14+HLA-DR ( %) |
84,0* (81,6 - 86,8) |
88,2 (85,9 - 90,3) |
Примечание. * - р≤0.05 в сравнении с показателями пациентов у которых сращение было достигнуто в срок
Несмотря на статистически значимые отличия, данные показатели в обеих группах не выходили за пределы нормативных границ, субпопуляционные нарушения отсутствовали. Абсолютное содержание натуральных киллеров в группе с нарушенным остеогенезом было достоверно выше, чем при нормальном течении посттравматического периода. Более высокими были абсолютные значения В-лимфоцитов, значения иммуноглобулинов классов A и G при этом в обеих группах достоверно не отличались, а содержание IgM при замедленной консолидации костной ткани было ниже, чем при нормальном течении посттравматического периода (табл. 3).
Таблица 3
Показатели гуморального иммунитета и цитокинового звена иммунной системы у пациентов со сросшимися переломами и несовершенным остеогенезом в сроки от 1,5 до 2 лет после травмы
Показатель |
Замедленная консолидация костной ткани |
Сращение перелома в сроки |
IgA (мг/мл) |
0,96 (0,74 - 1,75) |
1,11 (0,81 - 1,37) |
IgM (мг/мл) |
0,95* (0,71 - 1,13) |
1,49 (1,2 -1,9) |
IgG (мг/мл) |
11,4 (8,7 - 14,4) |
9,6 (6,2 - 17,5) |
IgЕ (МЕ/ед) |
67,8 (16,7 - 196,4) |
61,5 (16,9 - 106,4) |
ЦИК (о.е.) |
40,5* (30,9 - 77,8) |
33,0 (19,0 - 43,0) |
IL-1β (пг/мл) |
0 (0 - 0) |
0 (0 - 0) |
IL-4 (пг/мл) |
0 (0 - 1,68) |
0,09 (0 - 0,36) |
IL-6 (пг/мл) |
1,78 (0,97 - 5,23) |
1,23 (0,56 - 2,3) |
IL-8 (пг/мл) |
8,26 (2,03 - 13,6) |
6,25 (4,13 - 9,5) |
IL-10 (пг/мл) |
1,43 (0 - 4,01) |
0,29 (0 - 1,64) |
TNFα (пг/мл) |
1,64* (0,66 - 3,28) |
0 (0 - 0) |
IFNα (пг/мл) |
0,51 (0 - 6,7) |
0 (0 - 0) |
Примечание. * – р≤0.05 в сравнении с показателями пациентов у которых сращение было достигнуто в срок.
Более высоким в группе с нарушенным остеогенезом было как относительное, так и абсолютное количество клеток, несущих маркеры поздней активации Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR), и уровень ЦИК. Экспрессия HLA-DR на моноцитах была достоверно выше в группе с благоприятным течением посттравматического периода. При исследовании уровня сывороточных цитокинов, статистически значимые межгрупповые отличия были выявлены только в отношении TNFα, уровень которого был ниже в группе с замедленной консолидацией костной ткани.
Для того чтобы выявить, какие из показателей наиболее тесно связаны с замедленной консолидацией костной ткани, был проведен расчет ранговой корреляции Спирмэна. Наиболее высокий коэффициент Спирмена (0,5 и выше) был выявлен у TNFɑ (коэффициент Спирмена 0,61; значимость корреляции – 0,0001).
Обсуждение результатов. В группе больных с замедленной консолидацией костной ткани через 7 – 18 месяцев после закрытой травмы длинных трубчатых костей мы наблюдали более высокие значения Т-хелперов (CD3+CD4+), клеток, несущих маркеры ранней и поздней активации лимфоцитов, чем у больных с нормальной регенераторной активностью костной ткани, что в целом свидетельствовало об умеренной активации клеточного звена иммунной системы.
Интересными были результаты по изучению особенностей гуморального иммунитета. У пациентов с замедленной консолидацией костной ткани мы наблюдали более высокие абсолютные значения В-лимфоцитов, которые, по мнению ряда авторов, принимают участие в процессах регенерации костной ткани [6, 8]. При этом уровень IgM был ниже, а концентрации сывороточных IgA и IgG были приблизительно такими же, как у больных с нормальным течением посттравматического периода. По мнению О.В. Бердюгиной, CD19 и IgM являются факторами, отражающими регенерацию костной ткани [1]. Возможно, что, увеличение числа В – лимфоцитов (продуцентов антител) у пациентов с замедленной консолидацией костной ткани, является адаптивной реакцией иммунной системы, направленной на повышение выработки иммуноглобулинов.
В литературных источниках имеются указания на то, что количество моноцитов также относится к факторам, отражающим регенерацию костной ткани [3]. У пациентов с нарушениями остеогенеза нами было выявлено достоверное повышение абсолютного количества моноцитов, при этом экспрессии HLA-DR на моноцитах была достоверно ниже, чем в контрольной группе. Известно, что экспрессия HLA-DR на моноцитах – надежный маркер дисфункции моноцитов, связанной с увеличением риска инфекционных осложнений при таких патологических состояниях как травма, серьёзные ожоги, острый панкреатит, обширные хирургические вмешательства [4].
Полученные нами данные свидетельствует о некотором снижении способности моноцитов выполнять свою антигенпредставляющую функцию в группе с замедленной консолидацией костной ткани. Но, учитывая, что снижение экспрессии HLA-DR на моноцитах не критическое, мы считаем, что данный показатель не является диагностически значимым при нарушениях остеогенеза.
В настоящее время не вызывает сомнений сам факт участия цитокинов, как медиаторов межклеточных взаимодействий, в процессах регенерации костной ткани. В частности, TNFɑ способствуют созреванию, дифференцировке и активации остеокластов. Механизм резорбции костной ткани под действием TNFɑ обусловлен как способностью вызывать катаболизм костной ткани, так и препятствовать её восстановлению [5]. Возможно, этим объясняется повышение уровня сывороточного TNFɑ у больных с замедленной консолидацией костной ткани.
Наблюдаемые нами иммунологические нарушения у больных с нарушениями консолидации являются, на наш взгляд, вторичными и обусловлены сохраняющейся подвижностью костных отломков, нестабильностью металлоконструкций и отсутствием полноценного контакта костных отломков, металлозом, пролонгированным некрозом интерпонированных тканей.
Заключение
Таким образом, при нормальной репаративной активности костной ткани через 7 – 18 месяцев после травмы основные показатели клеточного иммунитета, гуморального иммунитета, цитокинового звена иммунной системы находятся в пределах границ физиологической нормы. Замедленная консолидация костной ткани, обусловленная отсутствием стабильной фиксации, характеризуется умеренной активацией клеточного иммунитета на фоне умеренного повышения TNFα.