Человек в процессе онтогенеза проходит постоянную адаптацию к изменяющимся условиям внешней среды, но его способности к ней ограничены [4]. При действии на организм факторов внешней среды его адаптация происходит в результате «адаптационного синдрома» [7]. Согласно современным данным, в адаптационном синдроме принимает непосредственное участие кора надпочечных желез [3, 6, 8]. Гормоны коры надпочечников оказывают влияние практически на все стороны жизнедеятельности организма и его системы.
В современной биологии и медицине большое значение имеет исследование влияния на организм алкогольной интоксикации. Употребление этилового спирта, в силу его физико-химических свойств и особенностей биологического и токсического действия, часто приводит к развитию патологических процессов в разных органах и тканях организма [5, 9]. Экспериментальные исследования показали, что все гормональные звенья надпочечников изменяются под действием алкоголя. По данным экспериментальных исследований экзогенная однократная дотация алкоголя с одной стороны ведет к повышению активности коры надпочечников и стрессовым реакциям, в то время как хронический его прием приводит к истощению адаптационных механизмов с разнонаправленным характером изменений в различных зонах коры [1]. Несмотря на многолетнюю историю изучения проблемы хронической алкогольной интоксикации, до настоящего времени аспекты их морфофункциональных изменений освещены недостаточно.
Материалы и методы исследования
Экспериментальные исследования проведены на белых беспородных крыс-самцах массой 200 – 210 г (возраст 1,5–2 мес), в количестве 96 животных, распределенных на контрольную и экспериментальные группы.
Контрольную группу составили животные, не потреблявшие алкоголь, и находившиеся в условиях вивария. Исследование включало 2 экспериментальные группы животных, получавших 15 % раствор этилового спирта в режиме свободной дотации в течении 60-ти суток (I группа) и 80-ти суток (II группа), при этом данный источник являлся единственным источником энтерального приема жидкости. Выбор 15 % раствора этанола был обусловлен указаниями на оптимальность данной концентрации для формирования у экспериментальных животных в течение относительно короткого периода изменений, соответствующих хронической алкогольной интоксикации [2]. Первую группу составили животные, употреблявшие 15 % раствор этанола в течение 60 суток. Материал получали на 60 сутки. Вторую группу составили крысы, употреблявшие раствор этанола в течение 80 суток. Забор материала проводили на 80 сутки.
Выведение животных из эксперимента производили в одно и то же время суток под эфирным наркозом путем декапитации. Для морфологических исследований надпочечных желез одну часть иссеченных тканевых блоков фиксировали в 10 % нейтральном формалине, другую – в течение 24 ч в жидкости Буэна. Проводилось как морфометрическое исследование, включавшее кариометрические измерения, изучение ядерно-цитоплазматического индекса (ЯЦИ) и ширины зон коры надпочечных желез, осуществлявшееся при изучении препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, так и исследования гистохимической активности РНК в ядрышке и цитоплазме клеток при использовании гистохимической реакции по Браше, (1942) в модификации Курника, оценка содержания белка в ядре и цитоплазме проводилась с помощью окрашивания сулема-бромфеноловым синим по D. Mazia, P. Brezer, M. Alfert (1953).
Стереометрические измерения проводили с использованием инструмента «линейка» в программе Adobe PhotoShop CS5, при этом проводилось не менее 300 измерений ядер и цитоплазмы клеток, два наибольших взаимно перпендикулярных значения. В дальнейшем для расчета объемов использовалась формула эллипсоида вращения.
Статистическая обработка полученных данных осуществлялась с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.1.
Результаты исследования и их обсуждение
При алкогольной интоксикации в течении 60-ти суток в препаратах надпочечных желез капсула представлена плотной соединительной тканью и не отличается от контроля. Клетки клубочковой зоны имеют строение, характерное для надпочечных желез групп виварного контроля. Они округлой и неправильно округлой формы, расположены клубочками. Цитоплазма кортикостероцитов умеренно оксифильна с более интенсивной окраской в клетках пучковой зоны.
В пучковой зоне при длительной дотации алкоголя отмечалось увеличение ее ширины (рис. 1), наиболее выраженными данные изменения были в II группе, и данная закономерность имела достоверные отличия по отношению к виварному контролю.
Рис. 1. Ширина пучковой зоны в контрольных и экспериментальных группах животных
Проведение изучения ширины зон коры надпочечных желез показало, что в группах животных, получавших экзогенную дотацию алкоголя на протяжении 60 и 80 суток, отмечалось уменьшение ширины клубочковой зоны, причем оно было более выражено во II группе экспериментальных животных, где изменения были статистически достоверными по сравнению с контрольной группой. Обращает внимание прогрессивно нараставшее стирание отличий границ клубочковой и пучковой зон в I и II группах животных.
Изучение динамики изменения ЯЦИ (рис. 2) показало достаточно выраженные и статистически достоверные изменения в I и II группах животных, получавших изолированную экзогенную алкогольную дотацию. При этом характер выявленных изменений был разнонаправленным. При длительности приема 60 сут. (I группа) отмечалось увеличение ЯЦИ по сравнению с контрольными группами, в то время как в II группе отмечалось уменьшение ЯЦИ.
Рис. 2. Ядерно-цитоплазматический индекс в клубочковой зоне в контрольной и экспериментальных группах
Проведение моделирования динамики зависимости ширины зоны коры, размера ядра, цитоплазмы клетки, ЯЦИ и гистохимических маркеров содержания белка в ядре и цитоплазме и РНК в ядрышке и цитоплазме показало, что уменьшение ширины КЗ коры у экспериментальных животных сопровождалось уменьшением площади сечения клетки с одновременным уменьшением содержания белка в цитоплазме, причем данные параметры находились в достаточно тесной корреляционной зависимости. Кроме того, увеличение длительности приема экзогенного этанола приводило в случае КЗ к последующему уменьшению размеров ядра и ЯЦИ, сопровождавшееся также уменьшением ширины КЗ.
В пучковой зоне при сопоставлении площади ядра, ЯЦИ и содержания общего белка в цитоплазме наблюдается четко выраженная тенденция, подтвержденная данными регрессионного анализа (r=0,55, p=0,04), к уменьшению ЯЦИ за счет увеличения площади ядра при уменьшении срока алкогольной дотации.
Указанные изменения морфометрических параметров при сопоставлении их с данными гистохимического исследования показали, что в группах животных, получавших изолированную дотацию алкоголя, выявлялось разнонаправленное изменение содержания общего белка в цитоплазме и ядрах клеток: при увеличении длительности приема алкоголя выявлялось снижение концентрации белка в ядре и увеличение его концентрации в цитоплазме клеток, при этом установлена выраженная тесная корреляционная зависимость между длительностью приема алкоголя, концентрацией белка и ЯЦИ. Сопоставление значений оптической плотности РНК ядрышка и белка в цитоплазме клеток и ядре показало, что увеличение содержания РНК сопровождалось одновременным увеличением объема ядер и в I группе указанные изменения были менее выраженными, чем в II группе, при этом значение коэффициентов регрессии свидетельствует о фазном характере изменений с тенденцией к истощению при более длительном приеме алкоголя (рис. 3, 4).
а б
Рис. 3. Динамика изменений содержания РНК в ядрышке, белка в цитоплазме клеток и объема ядра клеток пучковой зоны надпочечников в зависимости от срока алкогольной интоксикации в I (3 а) и II (3 б) группах
Рис. 4. Результаты регрессионного анализа изменения ЯЦИ от длительности приема алкоголя
Указанные изменения в определенной степени подтверждались соответствием фазного характера динамики гистохимических параметров оптической плотности РНК и общего белка в структурах ядра и цитоплазмы.
При анализе морфометрических показателей сетчатой зоны установлено, что ширина СЗ достоверно не изменялась у животных, получавших экзогенную дотацию алкоголя, при этом обращает внимание тенденция увеличения ее ширины в I и II группах экспериментальных животных на 10,8 и 11,3 %, а также отмечалось увеличение вариабельности данного показателя в II группе животных как по сравнению с контролем, так и по сравнению с I группой.
В сетчатой зоне при сопоставлении данных кариометрии, ЯЦИ и содержания белка в ядре установлено, что увеличение длительности приема экзогенного алкоголя сопровождалось уменьшением величины оптической плотности белка в ядре при сравнении ядер близкого поперечного сечения (рис. 5).
Сравнительный анализ данных гистохимического и морфометрического исследования позволяет предположить нарастание дистрофических процессов на фоне явлений кариопикноза при длительном приеме этанола.
Таким образом, хроническая алкогольная интоксикация приводит к значительным стереометрическим изменениям коры надпочечных желез в виде изменений ядерно-цитоплазматических индексов, за счет изменения, как размеров ядра, так и цитоплазмы, доминирующей тенденцией являлось уменьшение размеров ядра при увеличении срока приема этанола. Гистохимически установлено уменьшение содержания белка в ядре клетки на фоне увеличения его концентрации в цитоплазме, и обратная динамика РНК, что вероятно отражает процесс адаптации животных к хроническому приему алкоголя.
а
б
в
Рис. 5. Результаты моделирования соотношения морфометрических и гистохимических параметров в сетчатой зоне коры надпочечных желез у животных контрольной (а), I (б) и II (в) экспериментальных групп