Scientific journal
International Journal of Applied and fundamental research
ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,593

CLINICAL AND LABORATORY STUDY OF GENOTYPING OF MYCOPLASMA BY SEQUENCE ANALYSIS OF MULTIPLE GENES AND 16S RRNA SPACE REGION

Evstigneeva N.P. 1 Kuznetsova Y.N. 1
1 Federal state institution «Ural scientific research Institute of dermatovenerology and immunopathology» of the Ministry of health of the Russian Federation
1046 KB
To determine intraspecific genetic differences genital mycoplasmas identification and subsequent molecular – genetic analysis of the initial part (about 800 base pairs) gene 16S ribosomal RNA (rRNA) strains of M. hominis, allocated from the urogenital tract 59 women with inflammatory diseases of genitals, when excluded STIs. In 29 cases (49,2 %) revealed previously unknown mutation – replacement thymine on cytosine in the position 179 16S rRNA gene (position specified by a sequence NC_013511 in GenBank), which creates an additional restriction site for the enzyme enzyme Fsp4HI off in this place the DNA molecule. Found that mutant strains of M. hominis in most cases associated with inflammatory diseases of the upper divisions of the urogenital tract: endometritis, oophoritis and/or adhesive process. Strains of M. hominis, have this mutation was absent, significantly more prevalent in patients with inflammatory diseases of the lower section of the urogenital tract. Thus, circulating strains of M. hominis vary in degree of pathogenicity. After diagnosis and determination of indications for the treatment with antibacterial therapy is appointed. The drugs of choice for treatment of inflammatory diseases of the urogenital tract associated with M. hominis, according to the results of studying the sensitivity, are of doxycycline monohydrate and jozamitsin that meets the most previously published Russian and foreign studies as well as clinical guidelines for the management of patients with Mycoplasma infection.
mycoplasma
mutation
inflammatory diseases of the upper and lower divisions of the urogenital tract

Роль генитальных микоплазм в развитии воспалительных процессов органов урогенитального тракта до последнего времени дискутируется, а интерес к вопросу в определенной степени поддерживается высокой частотой выделения данных микроорганизмов из мочеполовых органов и возможным участием в нарушении репродуктивной функции [2, 17, 29].

Частота колонизации мочеполовых органов женщин микоплазмами, по данным отечественных авторов, варьирует в широких пределах – от 6,0 % (у лиц, не имеющих половых контактов) до 80,0 % [3, 13, 16]. Так Мавров И.И. (2002), Прилепская В.Н., Быковская О.В. (2007), Cwikel J.G. et al. (2006), Gupta A. et al. (2009), отмечают, что частота выявления Ureaplasma spp. составляет от 2,5 % до 26,0 %, M. hominis от 4,0 % до 15,0 %. В то же время Хрянин А.А. (2006), Кулаков В.И. с соавт. (2007) указывают, что M. hominis встречается в 20,0 – 53,0 % случаев, а U. urealyticum – в 30,0 – 76,0 %. Существенно реже обнаруживается M. genitalium – от 0,0 до 20,0 % [16,19]. Однако значительно чаще эти микроорганизмы выявляются в составе биотопа влагалища у лиц, имеющих ту или иную патологию: при циститах – у 60,0 – 75,0 % обследованных пациентов, бактериальном вагинозе – у 25,5 – 52,0 %, вагинитах – у 23,0 %, эрозиях шейки матки – у 37,9 %, эндометритах – до 40,0 %, бесплодии – у 22,0 – 85,0 %, привычном невынашивании беременности – у 45,0 – 75,0 % [4, 9].

Степень распространенности данных микроорганизмов в популяции большинство исследователей связывают с ранним возрастом начала половой жизни, низким социально-экономическим статусом, культурно-гигиеническими традициями, высокой сексуальной активностью, большим числом половых партнеров [8, 11, 12, 28].

У женщин U. urealyticum и M. hominis чаще обнаруживаются после инвазивных процедур (оперативные вмешательства, внутриматочные процедуры) [6,30]. M. hominis наиболее часто ассоциируют с бактериальным вагинозом и неспецифическим вагинитом. Предполагается, что микоплазмы могут существовать как симбиоты с другими бактериями, вызывающими дисбиоз влагалищной флоры, и самостоятельно [11, 16]. Однако их роль при бактериальном вагинозе и неспецифическом вагините остается неопределенной, поскольку многие исследования привели к противоречивым результатам. Keane F.E. с соавт. (2000) значительно более часто выявляли микоплазмы у пациенток с бактериальным вагинозом. В литературе имеются сообщения о возможной роли M. hominis в развитии уретрита, цервицита, воспалительных поражений органов малого таза, патологии мочевыводящей системы, при пиелонефритах, циститах и гломерулонефритах [20, 29]. Кроме того, имеются данные, свидетельствующие о выявлении M. hominis у пациентов при синдроме Рейтера [12] и возможной их роли в развитии перикардита [26].

Вопрос о том, какие условия являются решающими для реализации патогенного потенциала M. hominis, до настоящего времени остается невыясненным. Большинство исследователей считают, что об этиологической роли данного возбудителя можно с той или иной долей вероятности судить только по результатам количественного анализа [5, 7, 15]. Диагностическое значение имеет обнаружение микоплазм в концентрации более 104 колониеобразующих единиц в 1 мл исследуемого материала (КОЕ/мл). При этом подразумевается, что все штаммы M. hominis обладают одинаковым патогенным потенциалом, и решающая роль в развитии воспалительного заболевания принадлежит неким «условиям». В то же время, в доступной литературе отсутствуют данные о внутривидовой гетерогенности M. hominis по степени вирулентности, то есть способности вызывать патологический процесс.

Одним из достижений в развитии понимания механизмов, определяющих степень патогенности микроорганизмов, в том числе микоплазм, являются результаты сравнительного анализа геномов M. hominis, M. genitalium и U. parvum и выявления мутаций [24, 25, 27, 31]. Было показано, что из 537 генов, образующих геном M. hominis, 220 являются видоспецифическими, а 247 генов оказались идентичными у всех трех видов (коровые гены). Оставшиеся 70 генов по степени родства распределились следующим образом: 24 гена – идентичные у M. hominis и M. genitalium, 46 генов – идентичные у M. hominis и U. parvum. Авторы высказывают предположение о том, что наличие общих генов у представителей двух видов могло явиться результатом горизонтального переноса (horizontal gene transfer). Следует отметить, что, по данным авторов, из 247 коровых генов только три кодируют поверхностные мембранные белки, а ответственные за вирулентность гены, кодирующие, в основном, мембранные белки, оказались видоспецифичными. Учитывая возможность горизонтального переноса генов между M. hominis, M. genitalium и U. parvum, а также тот факт, что в работе Pereyre S. еt al. (2009) для проведения сравнительного анализа был использован геном одного конкретного штамма M. hominis (PG21), возможно предположить существование, наряду с условно-патогенными, патогенных штаммов бактерий данного вида, получивших гены вирулентности от близкородственных видов, занимающих одну экологическую нишу. Таким образом, одним из перспективных направлений изучения механизмов формирования вирулентности и определения степени патогенности микроорганизмов, в том числе микоплазм, являются результаты сравнительного анализа геномов и выявления мутаций [24, 25, 27, 31].

Цель исследования. Изучить молекулярно-генетическую основу внутривидовой гетерогенности штаммов M. hominis, являющуюся возможным фактором риска развития осложнений со стороны урогенитального тракта и обоснованием для назначения терапии.

Материалы и методы исследования

Для изучения геномной структуры и дифференциации по гену рибосомальной РНК штаммов M.hominis была обследована 631 пациентка репродуктивного возраста. Генитальные микоплазмы выделены из урогенитального тракта у 229 (36,3 %) пациенток: у 132 (57,6 %) в сочетании с различными возбудителями ИППП и УПМ в диагностически значимых титрах и у 97 (42,4 %) в виде моноинфекции, из них M.hominis диагностированы у 59 (60,8 %) женщин, M.genitalium – у 12 (12,4 %), U.urealyticum – у 26 (26,8 %) пациенток. С целью определения внутривидовых генетических различий штаммов M. hominis, были проведены идентификация и последующий молекулярно – генетический анализ начальной части (около 800 пар оснований) гена 16S рибосомальной РНК (рРНК) штаммов M. hominis, выделенных из уретры, заднего свода влагалища и цервикального канала 59 женщин в возрасте 16–52 лет (28,3 ± 8,7 лет) с воспалительными заболеваниями гениталий, ассоциированными с M. hominis, при исключенных ИППП.

Для культивирования, идентификации, количественного учета и определения чувствительности к 9 антибактериальным препаратам (доксициклин, джозамицин, офлоксацин, эритромицин, тетрациклин, ципрофлоксацин, азитромицин, кларитромицин, пристиномицин) Mycoplasma hominis были использованы диагностические реагенты in vitro для микробиологических исследований (Mycoplasma Duo, Mycoplasma Ist, Mycoplasma SIR).

Для определения молекулярно-биологических свойств и генной структуры M.hominis путем секвенирования изучено выявление прямой и обратной нуклеотидной последовательности 59 образцов отделяемого урогенитального тракта женщин, инфицированных M.hominis, при исключенных ИППП.

Для выделения штаммов M. hominis из исследуемого материала использовали питательную среду Хейфлика ЗАО НИЦФ (Санкт-Петербург). Выделение бактериальной ДНК из чистой культуры M. hominis проводили методом сорбции на силикагелевом носителе с помощью набора реагентов «ДНК-сорб-А» (ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва).

Амплификацию выбранного участка проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с олигонуклеотидными праймерами Bak11W – 5’ AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG 3’ и Bak2 – 5’ GGA CTA CCA GGG TAT CTA AT 3’ (Zucol F. et.al., 2006). использованы олигонуклеотидные праймеры ЗАО «Синтол» (Москва).

Для проведения ПЦР готовили 25 lm реакционной смеси, включающей: 2 ед. ДНК-полимеразы (ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва), 0,2 mM смесь dNTP, по 5 pmol праймеров Bak11W и Bak2, реакционный буфер (67 mM Трис-HCl (pH 8,3), 2,0 mM MgCl2), 10 lm ДНК. ПЦР проводили по следующей схеме: 1 цикл – 95 °С – 3 минут; 30 циклов – 95 °С – 10 секунд, 62 °С – 10 секунд, 72 °С – 30 секунд; и заключительный цикл – 72 °С – 5 минут.

Для анализа продуктов амплификации использовали электрофорез в 2 % агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием (0,5 мг/мл) и детекцией в ультрафиолетовом трансиллюминаторе.

Первичную структуру ДНК определяли методом прямого секвенирования по прямой и обратной последовательностям с праймерами Bak11W и Bak2 на автоматическом генетическом анализаторе ABI Prism 310 (Applied Biosystems, США) с использованием реакционной смеси ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit v.3.0 (Applied Biosystems, США) следуя рекомендациям производителя.

Выравнивание последовательностей нуклеотидов, их сравнение между собой и с последовательностями прототипных штаммов M. hominis проводили с использованием компьютерной программы MEGA. Из полученных нуклеотидных последовательностей часть была депонирована в базе данных GenBank под номерами EU443618 – EU443622.

Результаты исследования и их обсуждение

В результате молекулярно-генетического анализа штаммов M. hominis, выделенных в диагностически значимых титрах (104 и более КОЕ/мл) от 59 пациенток, в 29 случаях (49,2 %) была выявлена ранее не описанная мутация – замена тимина на цитозин в позиции 179 гена 16S рРНК (позиция указана по последовательности NC_013511 в GenBank), что создает дополнительный сайт рестрикции для фермента эндонуклеазы Fsp4HI, расщепляющей в данном месте молекулу ДНК.

В соответствии с полученными результатами пациентки были разделены на две группы: в первую группу вошли 29 женщин, у которых были обнаружены мутантные штаммы M. hominis, во вторую группу – 30 пациенток, от которых были выделены штаммы M. hominis, не имеющие мутации. Сравнительный анализ показал, что лишь 8 (27,6 %) пациенток первой группы были в возрасте 16 – 24 лет, 15 (51,8 %) женщин – 25 – 35 лет и 6 (20,6 %) – старше 35 лет. В то время как во второй группе 15 (50,0 %) пациенток были в возрасте 16 – 24 лет, 11 (36,7 %) возрасте 25 – 35 лет и лишь 4 (13,3 %) старше 35 лет.

Основными жалобами пациенток обеих групп было наличие патологических выделений из влагалища и зуд наружных половых органов различной степени выраженности.

Было отмечено, что длительное наличие симптомов заболевания (более 1 года) было характерно для 7 (21,4 %) пациенток первой группы и лишь 2 (6,7 %) второй группы (р≤0,05). В то же время, в первые несколько суток заболевания обратились 5 (16,7 %) женщин из второй группы, что вероятнее всего было связано с выраженными клиническими проявлениями воспалительного процесса, и лишь 1 (3,6 %) пациентка из первой группы (р≤0,05). Эти наблюдения подтверждает и тот факт, что пациентки второй группы в большинстве случаев обратились на прием самостоятельно, в то время как женщины, в отделяемом урогенитального тракта которых были выявлены мутантные штаммы M. hominis, были направлены для обследования акушерами-гинекологами или урологами.

Пациентки первой группы достоверно чаще (7 чел. – 24,1 %) по сравнению с пациентками второй группы (2 чел. – 6,6 %) указывали на перенесенные медицинские аборты в количестве от двух до пяти (р≤0,05), что могло быть связано с большим удельным весом пациенток старшего возраста в первой группе. На наличие внематочной беременности в анамнезе указали лишь 2 (6,9 %) пациентки из первой группы.

При сборе анамнеза установлено, что 20 (68,9 %) пациенток первой группы и 13 (43,3 %) пациенток второй группы ранее обследовались на ИППП (р≤0,05), из них у 16 (80,0 %) и 10 (76,9 %) женщин соответственно были выявлены возбудители урогенитальных инфекций, все женщины получали терапию антибактериальными препаратами. Одинаково часто у пациенток обеих групп ранее выявлялась хламидийная инфекция (40,0 % и 38,5 % соответственно, р≥0,05) и вульвовагинальный кандидоз (10,0 % и 7,7 %, р≥0,05). Бактериальный вагиноз и воспалительные заболевания, обусловленные генитальными микоплазмами (U.urealyticum, M.genitalium, M. hominis) достоверно чаще отмечены в анамнезе у пациенток второй группы (10,0 % и 30,8 % (р≤0,05); 20,0 % и 61,6 % соответственно (р≤0,001)). Сифилис (5,0 %), трихомониаз (15,0 %), аногенитальные бородавки (10,0 %), ЦМВ (5,0 %) ранее выявлялись только у пациенток с выявленными мутациями штаммов M. hominis, а ВПЧ у 2 (15,4 %) пациенток второй группы.

У 18 (62,1 %) пациенток первой и 14 (46,7 %) второй групп ранее были диагностированы воспалительные заболевания урогенитального тракта, обусловленные избыточной (104 и более КОЕ/мл) пролиферацией условно-патогенной микрофлоры: E.coli, Enterobacterium spp, S. aureus, Кlebsiella spp, Corynebacterium spp., St. agalactiae.

Данные клинического осмотра и бимануального обследования показали, что выраженные симптомы воспаления (гиперемия слизистой оболочки шейки матки, слизисто-гнойные выделения из цервикального канала и в сводах влагалища, контактная кровоточивость при заборе патологического материала) достоверно чаще отмечались у пациенток второй группы. Более частое выявление эктопий цервикального эпителия у пациенток данной группы (53,3 %) могло быть связано с высоким удельным весом женщин молодого возраста.

При клиническом и ультразвуковом обследовании пациенток эндоцервицит был выявлен у 13 (43,3 %) женщин второй группы и только у двух пациенток (6,9 %) первой группы (р≤0,001).

В то же время сальпингоофорит, эндометрит и/или спаечный процесс органов малого таза (ВЗОМТ) был диагностирован у 15 (51,7 %) женщин первой и у одной (3,3 %) пациентки второй группы (р≤0,001).

Таким образом, при сравнительном анализе результатов клинического и лабораторного обследования в группах женщин, инфицированных штаммами M. hominis, имеющими и не имеющими указанную мутацию, было обнаружено, что мутантные штаммы M. hominis в большинстве случаев ассоциированы с воспалительными заболеваниями верхних отделов урогенитального тракта: эндометритом, сальпингоофоритом и/или спаечным процессом. Штаммы M. hominis, у которых данная мутация отсутствовала, достоверно чаще выявлялись у пациенток с воспалительными заболеваниями нижнего отдела урогенитального тракта.

При бактериоскопическом исследовании мазков отделяемого заднего свода влагалища, окрашенных по Граму, выраженный лейкоцитоз отмечен у 8 (27,6 %) и 2 (6,7 %) пациенток первой и второй групп соответственно (р≤0,05). Повышенное количество лейкоцитов в цервикальном канале наблюдалось у 14 (48,3 %) пациенток первой и 15 (50,0 %) пациенток второй группы.

При бактериологическом исследовании влагалищного отделяемого с количественной оценкой титра M. hominis было установлено, что высокие титры возбудителя (105 – 109 КОЕ/мл) одинаково часто отмечались у пациенток как первой, так и второй групп (86,2 % и 86,7 %, соответственно). Различий по чувствительности/устойчивости к антибиотикам между штаммами микоплазм, имеющих и не имеющих мутацию в области гена 16S рРНК, не было выявлено.

У пациенток с выявленными мутациями штаммов M. hominis в большинстве случаев (81,8 %) отсутствовали или были в недостаточном количестве (менее 103 КОЕ/мл) лактобактерии. У пациенток с отсутствием мутаций штаммов M. hominis лактобактерии отсутствовали или были в недостаточном количестве в 58,3 % случаев (р≤0,05).

При определении чувствительности к антибактериальным препаратам не было выявлено достоверных отличий штаммов M. hominis с мутациями и без.

Все 59 штаммов (100,0 %) были чувствительны к доксициклину, джозамицину, офлоксацину, пристиномицину и устойчивы к эритромицину, азитромицину и кларитромицину.

Заключение

Проведенные исследования позволили сделать вывод о том, что циркулирующие штаммы M. hominis различаются по степени патогенности. Мутация с заменой тимина на цитозин в позиции 179 гена 16S рРНК может служить маркером повышенной вирулентности штамма, поскольку штаммы, имеющие упомянутую мутацию, достоверно чаще обнаруживаются у больных с воспалительными заболеваниями органов малого таза, в то время как штаммы, не имеющие мутации, в большинстве случаев выделяются от больных с воспалительным процессом нижнего отдела урогенитального тракта. Полученные результаты позволили сделать предположение о том, что штаммы M. hominis, имеющие мутацию в гене 16S рРНК, обладают более высоким патогенным потенциалом, по сравнению с «дикими» немутантными штаммами, что требует дифференцированного подхода к ведению пациенток.

После постановки диагноза и определения показаний к лечению назначается антибактериальная терапия. Рутинное определение чувствительности генитальных микоплазм к антибактериальным препаратам не требуется. Препаратами выбора для лечения воспалительных заболеваний урогенитального тракта, ассоциированных с M. hominis, согласно результатам изучения чувствительности, являются доксициклина моногидрат и джозамицин, что соответствует большинству ранее опубликованных отечественных и зарубежных исследований, а также клиническим рекомендациям [1] и протоколам ведения больных с микоплазменной инфекцией.