Scientific journal
International Journal of Applied and fundamental research
ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,593

PECULIARITIES OF METABOLISM OF FAT-SOLUBLE VITAMINS IN CHILDREN OF NATIVE AND ALIEN POPULATION OF THE NORTH

Kolodyazhnaya T.A. 1 Zaitseva O.I. 1
1 Federal State Budget Institution Scientific Research Institute of Medical Problems of the North of Siberian Department of the Russian Academy of Medical Sciences
1084 KB
The comparison of the researched indices of erythrocyte membranes in healthy children of native and alien population of Evenkia of school age (8-12 years): fat-soluble vitamin levels of alpha-tocopherol, phospholipid structure and physico-chemical properties that characterize the functional state of phospholipids and proteins (the definition of total turnover bilipidnogo layer, the surface mobility of the protein-lipid structure and parameters of tryptophan fluorescence). It’s found that alpha-tocopherol has different metabolic manifestations in relation to phospholipids and integral proteins, due to specific changes in the organism of a child, reflecting the prolonged exposure to extreme conditions of the North.
North
erythrocyte membrane
alpha-tocopherol
lipid metabolism
physical and chemical properties
children of native and aliens populations

Ключевые позиции здоровья и патологии обусловлены системой адаптивных морфофункциональных и биохимических перестроек в организме [7] и в биомембранах, в частности в ответ на постоянно возникающие во внешней среде изменения [1]. В условиях Севера организм ребенка подвергается воздействию целого ряда экстремальных факторов среды, которые способствуют существенным перестройкам всех его физиологических систем, в том числе и антиоксидантной системы клеточных мембран [4]. Известно, что характерным и неотъемлемым свойством биомембран для суровых условий Севера является повышение липидного обмена, что в свою очередь способствует активации окислительных процессов в них [4]. Важной составляющей антиоксидантной системы клеточного звена организма ребенка является жирорастворимый витамин токоферол. В природе токоферол имеет много форм, но наиболее широко распространенной формой является альфа-токоферол (α-ТКФ), имеющий самую высокую антиоксидантную биологическую активность среди известных молекулярных формул токоферолов [1,8]. При изучении содержания α-ТКФ в крови у жителей Севера, в том числе и у детского населения многие авторы отмечали его пониженный уровень [4,5]. При этом большинством исследователей данный факт оценивался однозначно, как недостаточное содержание данного витамина, требующее дополнительного введения его в организм ребенка [5]. Изученная нами по данному вопросу литература доказывает, что оценка потребности в α-ТКФ только по количественному признаку и по клиническому эффекту не может давать правильного ответа на вопрос о дополнительном введении в организм этого витамина (α-ТКФ). Это происходит в результате мультивалентного характера биохимических преобразований α-ТКФ в биомембранах, что выражается в существовании в естественных условиях «множества» метаболитов данного витамина [1,8], в том числе и прооксидантных. Накопление прооксидантных метаболитов α-ТКФ может происходить в результате нарушения баланса его сопутствующих участников (аскорбиновая кислота, ферментативные антиоксиданты, аминокислоты, микроэлименты и др.) [1,8]. На этом основании мы полагаем, что антиокислительные функции α-ТКФ не всегда связаны с его количественным содержанием в структуре биомембран. Они обусловлены качественными характеристиками, то есть биологической активностью [1]. Эта активность определена существованием в структуре биомембран двух основных форм α-ТКФ, различающихся по биохимическим свойствам и локализации: жирорастворимая, гидрофобная и «водорастворимая» гидрофильная [3,8].

Следует отметить, что наиболее изучено воздействие α-ТКФ на биологическую мембрану, находящегося в жирорастворимой форме. Данная форма витамина в биологически активном состоянии локализуется в области взаимодействия углеводородных «хвостов» легкоокисляемых фосфолипидов, в зоне её двойных связей. В этом случае действие α-ТКФ направлено на восстановление окисленных форм арахидоновой кислоты и сохранение легкоокисляемых фосфолипидов в функционально активном состоянии в структуре биомембран [1,8], что влияет на их текучесть [1].

Менее изучена так называемая гидрофильная форма α-ТКФ, с измененными биохимическими свойствами. В экспериментальной работе, проведенной А.А. Капраловым с соавт (1993) [3] было обнаружено, что многие биомембраны, в том числе и эритроцитарная имеют специфические белки липопротеидной природы, расположенные в их поверхностных областях, в которые поступают жирорастворимые формы α-ТКФ. Группой авторов было доказано, что в результате метаболических преобразований происходит изменение биохимических свойств α-ТКФ. Он становятся «гидрофильным» и, следовательно, менее «опасным», так как накопление окисленных форм в большей степени свойственно жирорастворимому витамину α-ТКФ [6], что способствует снижению его биологической активности вплоть до смены «полярности» воздействия от антиоксидантной к прооксидантной.

Учитывая тот факт, что растущий организм ребенка в условиях Севера испытывает двойную окислительную нагрузку (физиологическую и экологическую), мы полагаем, что на Севере существует система морфофункциональных и биохимических перестроек в организме и в биомембранах, в частности. Они направлены на уменьшение уровня жирорастворимых «опасных» форм витамина α-ТКФ и образование «безопасных» его метаболитов. Для доказательства данной гипотезы необходимо выявление функциональной направленности (антиоксидантной или прооксидантной) альфа-токоферола, что будет возможным при изучении всех известных структурных компонентов биомембран, биохимически и функционально связанных с α-ТКФ (фосфолипиды, интегральные белки и их биофизических характеристик). До настоящего времени α-ТКФ оценивался только по количественному показателю и не изучался во взаимосвязи со структурными фосфолипидами и интегральными белками. Поэтому целью нашей работы явилось изучение взаимодействия α-ТКФ с содержанием основных структурных компонентов эритроцитарных мембран и с их физико-химическими характеристиками.

Материалы и методы исследования

Исследованы практически здоровые дети в возрасте от 8 до 12 лет, проживающие на Севере, в Эвенкии (пос. Тура): дети пришлого населения − 31 человек и коренного населения − 52 человека. Всего исследовано 83 человека.

В мембранах эритроцитов определяли липидный спектр методом тонкослойной хроматографии [9], уровень жирорастворимого витамина альфа-токоферола по методу [10], физико-химические свойства – методом измерения флюоресценции спектров собственной флуоресценции и взаимодействия биомембран с зондами [2]. Данные измерения производились на спектрофлуориметре MPF – 4 марки «Хитачи» (Япония). Исследование физико-химических свойств мембран эритроцитов проводилось по 4 тестам. 1. Определение уровня триптофановых групп белков в липидном слое мембран по калибровочной кривой с использованием стандартного раствора триптофана (длина волны испускания 334 нм и длин волны возбуждения 284 нм) [2]. 2. Оценка текучести жирнокислотных остатков углеводородов мембранных фосфолипидов по эксимеризации пирена (длина волны испускания 350 нм, возбуждения – 340 нм) рассчитывалась по соотношению эксимеры/мономеры [2]. 3. Определение степени подвижности поверхностных белково-липидных структур мембран эритроцитов по характеристики обратной величины анизотропии мембран с встроенным зондом 1-анилино-нафталин-8 сульфонат (АНС) (длина волны испускания 400 нм., возбуждения – 360 нм.) [2]. 4. Определение показателя степени вращательной подвижности молекул триптофанилов ВПМТ мембран эритроцитов по характеристике обратной величины анизотропии триптофановых групп белков биомембран (1/ВПМТ) (длина волны испускания 400 нм., возбуждения – 360 нм) [2].

Применялся коэффициент асимметрии текучестей (КАТ), определяемый по отношению показателя текучестей поверхностных слоев мембран (1/анизотропии зонда АНС) к показателю текучести общего слоя фосфолипидов.

Математическую обработку полученных результатов проводили с использованием статистического пакета прикладных программ BIOSTAT, ver. 6.0. (StatSoft Inc. США). Все полученные результаты проверялись на нормальность распределения с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Для количественных признаков использовался непараметрический U-критерий Манн-Уитни при сравнении двух несвязанных выборок. Изменения считаются статистически значимыми при уровне значимости Р< 0,05. Анализ зависимости признаков проводится с помощью расчета и оценки значимости непараметрического коэффициента корреляции по Спирмену. При значении Р< 0,05 регрессионная модель адекватно описывает взаимосвязь признаков. Результаты исследования количественных параметров в группах сравнения представлены в виде Ме – медиана, (Min-max).

Результаты исследования и их обсуждение

При анализе уровня жирорастворимого витамина альфа-токоферола в эритроцитарных мембранах (ЭМ) у детей, проживающих в Эвенкии не выявлено статистически значимых различий, связанных с этнической принадлежностью (табл. 1).

Таблица 1

Показатели липидного обмена и жирорастворимого витамина альфа-токоферола в эритроцитарных мембран у детей коренного и пришлого населения Эвенкии от 8 до 12 лет (Me 25 ‰-75 ‰)

Показатели

Дети эвенков

n=52

Дети пришлого населения

n=31

Степень достоверности р

1

2

3

4

Альфа-токоферол, мкмоль/л

8,8850

(6,4200-9,7600)

9,180

(7,420-11,260)

p=0,1282

Общие фосфолипиды,

ммоль/л

1,8075

(1,7145-1,9730)

1,7010

(1,6310-1,8910)

р =0,0244

Фосфатидилхолин,

ммоль/л

0,8665

(0,8010-1,0110)

0,8010

(0,7740-0,8670)

р =0,0244

Фосфатидилэтанол-

амин, ммоль/л

0,4620

(0,4205-0,5320)

0,4380

(0,387-0,521)

р =0,3968

Фосфатидилсерин +

фосфатидилинозитол,ммоль/л

0,1325

(0,1095-0,1520)

0,1540

(0,097-0,1480)

р =0,167795

Сфингомиелин, ммоль/л

0,2265

(0,1960-0,2680)

0,2290

(0,1740-0,2740)

р =0,689066

Лизофосфатидилхо- лин, моль/л

0,0420

(0,0330-0,0600)

0,0350

(0,0260-0,0440)

р =0,0010

ЛФХ/ФХ, отн.ед

0,0474

(0,0384-0,0640)

0,0416

(0,0345-0,0520)

р =0,0722

Учитывая локализацию и известные функциональные свойства липидрастворимого витамина α-ТКФ, для выявления особенностей его метаболизма у детей Севера мы провели сравнительный анализ липидного и фосфолипидного спектра ЭМ, их физикохимических свойств и выявили следующие этнические различия. У детей пришлого населения по сравнению с детьми эвенков было отмечено статистически значимое снижение общих фосфолипидов (ОФЛ) в структуре ЭМ (р=0,0024; р<0,001) за счет фракции фосфатидилхолина (ФХ) (р=0,0024 ) и его метаболита лизофосфатидилхолина (ЛФХ) (р=0,0010). Немногочисленные изменения в фосфолипидном составе ЭМ имело аналогичные трансформации в показателях физико-химических свойств. Они были выражены в повышении величины показателя вращательной подвижности молекул триптофанилов (ВПМТ) у детей пришлого населения Эвенкии (р=0,0465) и в показателе интегрального коэффициента асимметрии текучестей эритроцитарных мембран (КАТ) (подвижность поверхностного слоя ЭМ/текучесть общего слоя фосфолипидов) (р=0,0173) (табл.2), характеризующий функциональное состояние фосфолипидов.

Таблица 2

Показатели физико-химических свойств эритроцитарных мембран у детей коренного и пришлого населения Эвенкии от 8 до 12 лет (Me 25‰-75‰)

Показатели

Дети эвенков

n=52

Дети пришлого населения

n=31

Степень достоверности р

по U тест M-W

1

2

3

4

Триптофановые,

группы белков, мг/%

0,2700

(0,2400-0,3200)

0,2800

(0,2600-0,3000)

р = 0,8725

1

2

3

4

Текучесть, отн.ед.

0,5065

(0,4090-0,5630)

0,4210

(0,3680-0,5970)

р = 0,3022

Подвижность молекул триптофанилов,

(ПМТ) отн.ед

2,1622

(2,0576-2,3530)

2,3040

(2,1459-2,4330)

р =0,0465

Подвижность поверхностного слоя, отн.ед.

2,1622

(2,0576-2,3530)

2,3923

(2,2173-2,6810)

р =0,7701

Коэффициент асимметрии, текучести, (КАТ), отн.ед.

4,9294

(4,1429-6,200)

6,2229

(4,1322-6,7220)

р = 0,0173

Снижение уровня содержания общих фосфолипидов за счет фракции фосфатидилхолина (ФХ) указывает на менее устойчивую структуру ЭМ у детей пришлого населения Эвенкии. Это, по нашему мнению, свидетельствует о неоднозначных потребностях в антиоксидантах, в том числе и в α-ТКФ. Однако, как было изложено выше, нами не выявлены этнические различия в содержании абсолютного количества этого витамина в их ЭМ. Произведя корреляционный анализе с участием липидрастворимого α-ТКФ и исследуемых показателей нами были получены неоднозначные молекулярные взаимосвязи, доказывающие, что этот витамин у детей коренного и пришлого населения имеет различные метаболические проявления по отношению к мембранным фосфолипидам и интегральным белкам (рис. 1). Так, у детей пришлого населения α-ТКФ в большей степени проявлял свои липидрастворимые качества. Это выражалось в наличии прямых корреляционных взаимосвязей с показателями, отражающими функциональное состояние липидной структуры, причем как гидрофильного ( подвижности поверхностного слоя фосфолипидов в месте его контакта с белком) (r=0,3909, р=0,0030, так и гидрофобного отделов фосфолипидов (текучести) (ТЕК) (r=0,4346, р=0,0146), а так же их соотношения коэффициента асимметрии текучестей (КАТ) (r=0,5293, р=0,0022) (рис.1,а). Наличие прямой корреляционной взаимосвязи данного показателя у детей пришлого населения Эвенкии с интегральным коэффициентом, характеризующим работу фосфолипаз (ЛФХ/ФХ) [1] (r=0,5282, p=0,0022) свидетельствует о том, что при усилении работы данного фермента (повышении величины интегрального коэффициента ЛФХ/ФХ) растет величина другого интегрального коэффициента, КАТ. Это свидетельствует об усилении степени липидного обмена, неотъемлемо связанного с повышением перекисного окисления липидов (ПОЛ). Поэтому повышение данного показателя (КАТ) у детей пришлого населения, являясь адаптивным свойством, при неблагоприятных условиях может быть признаком, отражающим дестабилизационные процессы в эритроцитарных мембранах.

На представленной схеме (рис. 1,а), характеризующией корреляционные взаимосвязи хорошо видно, что α-ТКФ опосредованно через показатель КАТ связан с работой фосфолипаз. В случае повышения в ЭМ липидрастворимого α-ТКФ у детей пришлого населения могут провоцироваться дестабилизационные процессы.

Совершенно иная картина молекулярных взаимодействий наблюдается у детей эвенков. Следует отметить, что в их ЭМ каких либо взаимосвязей α-ТКФ с показателями фосфолипидов, отражающих как их количественное, так и функциональное состояние, не выявлено. По нашему мнению это свидетельствует о метаболических преобразованиях в структуре ЭМ и в самом витамине (α-ТКФ), в результате которых данный витамин, по всей видимости, получил новые качества. На представленной схеме (рис.1,б) отчетливо видно, что модифицированная форма альфа-токоферола имела слабо выраженное прямое влияние на изменение показателя величины (ВПМТ) (r=0,3834, p=0,0060) у детей эвенков. При этом необходимо отметить, что по нашему наблюдению выше названный показатель отражает чувствительность молекул интегральных белков на изменение внешних факторов [5]. Однако другие исследователи, имея дело с патологическими изменениями в клетках крови (лимфацитов) интерпретировали данный факт (повышение подвижности гидрофобной части молекул триптофанилов) как дестабилизационный, характеризующий повышение окислительных процессов [2]. Учитывая выше изложенное сравнительное снижение данного показателя у детей эвенков, по всей видимости, свидетельствует о более устойчивой к внешним факторам садаптированной работе ферментов. Об этом же можно судить по другой корреляции показателя ВПМТ с показателем текучести, отражающим состояние общего билипидного слоя. Обратное направление данного молекулярного взаимодействия (r=−0,4204, p=0,0015) (рис.1,б) подтверждает, что повышение величины показателя ВПМТ может способствовать снижению степени текучести ЭМ, что является неблагоприятным признаком. В то же самое время выше названная взаимосвязь характеризует сравнительное снижение молекулярной подвижности в гидрофобной зоне триптофанилов ЭМ (ВПМТ) у детей эвенков как позитивное. В итоге на представленной схеме (1,б) видно, что наличие прямой корреляционной взаимосвязи α-ТКФ с показателем ВПМТ указывает на то, что повышение модифицированной формы данного витамина (α-ТКФ) в ЭМ может инициировать дестабилизационные изменения. Данный факт также имеет корреляционное подтверждение в виде выявленной прямой взаимосвязи величины показателя ВПМТ с уровнем легкоокисляемых фосфолипидов (ЛОФЛ) (r=0,3049, р=0,0280). Несмотря на отсутствие взаимосвязей с отдельными фракциями ЛОФЛ (ФЭА+ФС+ФИ) и слабую выраженность степени взаимодействия данная корреляция показывает, во-первых, качественные характеристики этих фосфолипидов (накопление окисленных форм), во-вторых, «виновника» в этом. На схеме (рис.1,б) предоставленный факт (изменение качественных характеристик ЛОФЛ) обусловливается, по всей вероятности так же α-ТКФ, но его модифицированная форма оказывает воздействие не на углеводородную гидрофобную зону ЛОФЛ мембран эритроцитов, а на гидрофильную область «головки» фосфолипидов. Подтверждением этому служит выявленная корреляционная взаимосвязь α-ТКФ, с ЛОФЛ через посредничество с показателем величины ВПМТ, которая характеризует степень молекулярной подвижности в гидрофобной зоне интегральных белков ЭМ, в которой находятся гидрофильные «головки» их фосфолипидов, являющиеся активаторами работы ферментов или запускающими при неблагоприятных условиях дестабилизационные процессы [1].

Заключение

Проведенное нами комплексное исследование эритроцитарных мембран (ЭМ) у детей коренного и пришлого населения школьного возраста показало, что α-ТКФ имеет различные метаболические проявления по отношению к фосфолипидам и интегральным белкам у детей коренного и пришлого населения. Это, по всей вероятности, обусловлено специфическими стойкими перестройками гормонально-метаболических параметров организма ребенка, эвенков, отражающими воздействие экстремальных факторов Севера. У детей же пришлого населения мы имеем дело с метаболическими проявлениями α-ТКФ, характерными для средних широт, основное различие которых заключается в участии в ключевых антиокислительных процессах их ЭМ в большей степени жирорастворимой формы α-ТКФ. Этот витамин имеет взаимодействие с углеводородной зоной ЛОФЛ и, следовательно, влияет на их функциональные характеристики в виде подвижности как общего билипидного слоя (гидрофобного) так и поверхностного (гидрофильного). В целом α-ТКФ участвует в регуляции липидного обмена в виде воздействия на работу фосфолипаз, что сопоставимо с литературными данными [1]. Хотя эта взаимосвязь α-ТКФ с показателем, характеризующим работу фосфолипаз (ЛФХ/ФХ) выявлена опосредованно через показатель величины интегрального коэффициента КАТ она имеет одно и тоже прямое направление, которое свидетельствует, что повышение в эритроцитарных мембранах жирорастворимого α-ТКФ при неблагоприятных условиях может вызывать дестабилизационные процессы.

В ЭМ детей коренного населения наблюдается отсутствие молекулярных взаимодействий количественного показателя альфа-токоферола с фосфолипидами, причем, как с их количественным содержанием, так и функциональными характеристиками (физико-химических свойств, характеризующих функциональную активность углеводородной части фосфолипидов). Предоставленный факт свидетельствует о метаболических преобразованиях данного витамина, в результате которых большая часть α-ТКФ получила новые биохимические свойства, изменившие его локализацию в ЭМ. Полученные новые качества позволило модифицированному α-ТКФ в структуре ЭМ у детей эвенков осуществлять более тонкую регуляцию на молекулярном внутри белковом уровне (гидрофобной зоны триптофанилов), что является как первичной реакцией фермента в ответ на воздействие рецепторов, так и пусковым дестабилизационным механизмом в реализации основных эффектов внешнего воздействия.

Таким образом, выявлено, что в экстремальных условиях Севера у детей школьного возраста пришлого населения несбалансированный рост жирорастворимой формы альфа-токоферола в структуре эритроцитарных мембран может спровоцировать дестабилизационные процессы. У детей коренного населения модифицированная форма α-ТКФ также может способствовать дестабилизационным процессам, но они будут менее выражены, что обусловлено неоднозначной биохимической природой α-ТКФ.