В последние десятилетия в практике биомедицинских исследований широко используется холодная плазма. Активные факторы плазмы – радикалы, ионы и электроны из области разряда, которые с потоком газа попадают на поверхность объекта [1]. Излучение холодной плазмы в таких устройствах играет определенную роль, но не является решающим. Последние достижения в области генерирования и применения холодной плазмы в биологии и медицине анализируются в обзоре [2].
При обработке холодной плазмой активные частицы плазмы не проникают вглубь объекта, а контактируют только с поверхностью. Когда газоразрядной плазмой обрабатывается жидкость, распространение активных частиц внутрь возможно только при перемешивании. Излучение плазмы, в отличие от частиц плазмы, может проникать в жидкость на значительную глубину и благодаря вторичным реакциям создавать там определенную концентрацию активных частиц, если жидкость прозрачна для излучения плазмы. Поэтому разработка источника излучения плазмы с возможностью создания внутри биологического объекта концентрации активных частиц и локальной активацией свободно-радикальных процессов, например, в опухолевом узле является актуальной.
Обычно, при разработке приборов для медицины, конструкторы детально исследуют физику процесса, приводящего к генерации плазмы, изучают ее состав, создают макет прибора, и уже затем рассматривают биомедицинские возможности конкретного вида плазмы. Авторы данной работы поступили наоборот: исходя из имеющихся технических возможностей, был найден режим генерации плазмы, при котором под действием излучения плазмы в воде достигается максимальный химический эффект [3], что обеспечивало оптимальные условия воздействия на объект.
В настоящей работе даются характеристики генератора и краткий обзор результатов, полученных авторами ранее при анализе физико-химических процессов, происходящих под действием излучения плазмы искрового электрического разряда на воздухе. Основное внимание уделено образованию сильного окислителя – пероксинитрита и комплекса, состоящего из пероксинитрита и пероксиазотистой кислоты и окислительно-восстановительным реакциям под действием этих частиц.
Источник излучения
Использовался генератор излучения плазмы искрового разряда ИР-10, описанный в работе [4]. Частота повторения импульсов составляла 10 Гц. Длительность переднего фронта импульса 50 нс. Полная длительность импульса 100 мкс. Энергия, выделяемая в импульсе, 5,9 10-2 Дж. Плотность потока энергии фотонов УФ-С диапазона за время длительности импульса (100 мкс, 10 Гц) на расстоянии 1 см от электродов (импульсная мощность) составляет 2 Дж/см2, средняя мощность излучения на том же расстоянии равна (2 ± 0.3) 10-3 Дж см-2 с-1. Максимум спектра излучения лежит при λ = 220 нм. По мере остывания искрового шнура максимум спектра излучения смещается в сторону более длинных волн и проходит весь УФ и видимый диапазон до 800 нм. Основными реакционно-способными частицами являются радикалы HO2• и пероксинитрит ONOO-. Перекись водорода и озон образуются, их стационарная концентрация ~ 10-6 моль/л [5], но они являются существенно менее активными продуктами, и при такой концентрации не могут играть заметную роль. Характеристики основных активных частиц приведены в табл. 1.
Гидроксильные радикалы могут образовываться во вторичных реакциях. Их выход измерялся непосредственно, но они не были обнаружены [4]. Прямое образование гидроксильных радикалов за счет диссоциации воды H2O a H• → OH• невозможно на основании закона сохранения энергии, так как для осуществления этого процесса энергии фотонов с длиной волны 200-280 нм недостаточно.
Таблица 1
Начальные выходы и стационарные концентрации основных продуктов, образующихся в дистиллированной воде под действием излучения плазмы импульсного искрового электрического разряда на воздухе генератора ИР-10
|
Продукт |
Начальный выход, моль (л с)-1, эксперимент [4] |
Стационарная концентрация, моль/л, расчет [5] |
|
HO2 |
(1,2 0,3) 10-6 |
5,97 10-7 |
|
O |
2 10-6 * |
4,43 10-11 |
|
N2O |
1,1 10-6 * |
2,48 10-5 |
|
NO2- + NO3- |
(5,8 1,6) 10-7 |
Накапливается |
|
ONOO- |
Не определен |
1,53 10-6 (рН0 = 7) |
|
NH4+ |
(1,7 0,5) 10-10 |
Накапливается |
|
H2O2 |
Не определен |
1,66 10-6 |
|
O3 |
Не определен |
1,03 10-6 |
|
OH |
Не определен |
3,91 10-9 |
Примечание.* выход оценен исходя из измеренного значения выхода HO2• и предполагаемой схемы образования продуктов.
Образование активных частиц под действием излучения плазмы газового искрового разряда происходит именно в жидкости. Эксперименты, выполненные в работе [6] с перекрыванием пучка простым и кварцевым стеклом, которое закрывало прямой контакт жидкой и газовой фазы, а также с непрозрачным для света поглотителем, устанавливаемым выше поверхности жидкости так, чтобы не препятствовать попаданию в жидкость частиц из газовой фазы, показали следующее. 1) Активные частицы образуются в самой жидкости под действием излучения с длиной волны 200-280 нм. 2) Никакие активные частицы из газовой фазы, которые образуются в самом разряде, на поверхность жидкости не попадают. Активные частицы, образующиеся в момент разряда в зазоре между электродами, при их высокой концентрации гибнут во взаимодействиях между собой [3]. Образующиеся при этом вторичные продукты являются стабильными соединениями, проявляющими малую активность. Среди таких продуктов в работе [6] методами ИК-спектроскопии обнаружены органические соединения и соединения азота (в частности, нитрозамины).
Отсутствие заметного влияния газовой фазы на выход активных частиц объясняется тем, что в газе теряется пренебрежимо малая доля энергии излучения, практически вся энергия поглощается в жидкости.
Механизм воздействия излучения газоразрядной плазмы на субстрат
Первичными активными частицами, образующимися под действием импульса излучения в воде, являются радикалы HO2• и пероксинитрит ONOO- [4]. Радикал HO2• является окислителем. Пероксинитрит быстро распадается, его время жизни в нейтральной среде ~ 1.2 с. Продуктами его распада могут быть ионы NO2- и NO3-. Ионы NO2- могут проявлять как окислительные, так и восстановительные свойства. При изомеризации пероксинитрита ONOO- → NO3- степень окисления азота меняется, она равна +3 для пероксинитрита и +5 для иона NO3-. Следовательно, при изомеризации пероксинитрита может происходить восстановление. Таким образом, излучение плазмы может инициировать как окисление (в том числе цепное окисление радикалами HO2•), так и восстановление. Восстановительными свойствами кроме ионов NO2- обладает пероксиазотистая кислота ONOOH. Для нее pKa = 6.8 и она существует в нейтральной и кислой среде. Сам пероксинитрит обладает преимущественно окислительными свойствами.
Если в растворе присутствуют органические соединения (биологическая проба), то первичные активные частицы взаимодействуют в первую очередь с ними. При этом они сразу расходуются и вторичные активные частицы не образуются. Вторичные активные частицы начинают образовываться только после того, как вещества, реагирующие с первичными частицами, будут израсходованы. Это проявляется в следующем. При обработке дистиллированной воды ее рН после обработки за время больше 1 минуты заметно уменьшается, и продолжает быстро уменьшаться со временем обработки. Когда в растворе присутствуют вещество, например, если обрабатывается излучением плазмы раствор Хенкса или альбумина, первые минуты рН практически не меняется, потом рН начинает уменьшаться, но уменьшение много медленнее, чем в чистой воде.
Образование долгоживущего комплекса (ONOOH … ONOO•)
Импульсный характер излучения обеспечивает высокую концентрацию активных частиц в обрабатываемом растворе, поэтому оказалось возможным образование комплекса (ONOOH … ONOO-) [7]. Спектрофотометрически комплекс не обнаруживается, но его можно обнаружить по продукту его распада: пероксинитриту. Пероксинитрит имеет полосу поглощения при λ = 301 нм, коэффициент экстинкции ε = 1670 л(моль см)-1. Сразу после обработки и в течение 3 суток после линия 301 нм не обнаруживается. Она начинает появляться на четвертый день после обработки, оптическая плотность достигает максимума на 8–10 день и линия пропадает через 14 дней. Максимальная мгновенная концентрация пероксинитрита составляет [ONOO-] = (2 ± 1) 10-5 моль/л [7]. Сразу после обработки и в течение 14 суток после наблюдается уменьшение рН раствора от нейтрального до рН ~ 2.5. Это можно объяснить распадом пероксинитрита ONOO- a NO3-. Исходя из изменения рН концентрация пероксинитрита, образующегося сразу после обработки и за 14 суток после, составляет [ONOO-] = (1.8 ± 0.4) 10-3 моль/л.
Образование комплекса (ONOOH … ONOO-) изучалось в дистиллированной воде (рН0 = 5.9) под действием излучения плазмы искрового разряда на воздухе в работе [8]. Использована реакция спиртового раствора стабильного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (ДФПГ•) с пробой воды, обработанной излучением плазмы. Жидкость, обработанная излучением плазмы, после облучения смешивалась со спиртовым раствором ДФПГ• в соотношении 1:1. Измеряли спектр поглощения смеси в диапазоне длин волн 200–800 нм. Наблюдали изменения оптической плотности линий при длинах волн 330–360 нм и 520 нм. Реакция облученной воды с ДФПГ• не может быть инициирована пероксинитритом. Из-за пространственных затруднений стабильный радикал не может взаимодействовать со сложными соединениями, какими являются активные формы кислорода. Он является плохим индикатором активных форм кислорода. Основной канал расходования ДФПГ• – взаимодействие с самым легким атомом – водородом. Пероксиазотистая кислота, которая образуется при распаде комплекса (ONOOH … ONOO-), может быть донором водорода, поэтому реакция с ДФПГ• позволяет оценить ее концентрацию. Появление пероксиазотистой кислоты идентифицировано на 4-й день после обработки излучением, и она пропадает на 13-й день. Максимальная мгновенная концентрация пероксиазотистой кислоты достигается на 5 – 7 день и составляет [ONOOH] = (1.5 ± 0.5) 10-5 моль/л. Таким образом, образование комплекса, включающего пероксинитрит и пероксиазотистую кислоту, подтверждается двумя независимыми методиками. Обеими методиками получены примерно одинаковые концентрации пероксинитрита и пероксиазотистой кислоты ~ 2 10-5 моль/л и время жизни комплекса 13 – 14 дней.
Возможности применения источника излучения
Полученные в работах, цитируемых выше, характеристики источника излучения плазмы искрового разряда на воздухе позволяют анализировать процессы, происходящие под действием излучения. Дополнительную информацию о характере процессов можно получать, сравнивая воздействие разных источников излучения. В работе [9] проведено сравнение характеристик излучения генератора ИР-10 и ртутной лампы низкого давления ДБК-9. Характеристики приведены в таблицах 2 и 3.
Таблица 2
Характеристика источников УФ-излучения ИР-10 и ДБК-9
|
Искровой разряд, ИР-10 |
Ртутная лампа низкого давления ДБК-9 |
||
|
Энергия в импульсе |
5,9 10-2 Дж |
Мощность лампы |
9 Дж/с |
|
Частота повторения импульсов |
10 Гц |
Режим работы |
Непрерывный |
|
Максимум сплошного спектра излучения |
220 нм |
Длина волны излучения |
253,7 нм |
|
Плотность фотонов на расстоянии 1 см от электродов * |
1,26 10-10 моль(см2 с)-1 |
Плотность фотонов на расстоянии 3 см от лампы * |
5,4 10-8 моль(см2 с)-1 |
|
Плотность потока энергии на расстоянии 1 см от электродов * |
(2 ± 0,3) 10-3 Дж(см2 с)-1 |
Плотность потока энергии на расстоянии 3 см от лампы (по паспорту) * |
2,6 10-2 Дж(см2 с)-1 |
Примечание.* указано расстояние от источника излучения до места, где установлен образец.
Таблица 3
Начальные выходы активных частиц (эксперимент)
|
Продукт |
Искровой разряд ИР-10 |
Ртутная лампа низкого давления ДБК-9 |
|
HO2• |
(1,2 ± 0,3) 10-6 моль(л с)-1 |
(1,1 ± 0.5) 10-6 моль(л с)-1 |
|
NO3- + NO2- |
(5,8 ± 1,6) 10-7 моль(л с)-1 |
(3,4 ± 1) 10-9 моль(л с)-1 |
|
NH4+ |
(1,7 ± 0.5) 10-10 моль(л с)-1 |
(2,5 ± 1,5) 10-8 моль(л с)-1 |
Из таблиц видно, что интенсивность УФ-излучения ртутной лампы примерно в 400 раз больше интенсивности излучения ИР-10. Однако выход радикалов HO2• для обоих источников практически одинаков. Выход кислотных остатков (которые образуются при распаде пероксинитрита и пероксиазотистой кислоты) под действием ИР-10 на два порядка больше, чем для ртутной лампы.
Сравнение выходов тиоловых SH- групп, образующихся при облучении альбумина, позволило идентифицировать механизм их образования [10]. Под действием ИР-10 происходит восстановление дисульфидных SS групп пероксиазотистой кислотой, а под действием излучения УФ-лампы восстановление происходит через возбуждение инициатора, которым является содержащийся в альбумине триптофан.
Заключение
Описаны характеристики источника излучения плазмы искрового разряда на воздухе. Особенностью такого источника является возможность образовывать под действием излучения в обрабатываемом объекте комплекс, состоящий из пероксинитрита и пероксиазотистой кислоты. Время жизни комплекса до 14 суток. Большое время жизни комплекса позволяет высокоактивным частицам проникать внутрь клетки и производить сильный цитотоксический эффект.
Простота конструкции генератора ИР-10 и малая потребляемая энергия при большом выходе активных частиц позволяет рассчитывать, что рассмотренный источник излучения найдет широкое применение в практике медико-биологических исследований.