В последние десятилетия сканирующая электронная микроскопия вошла во многие области науки и техники. Этот метод используют для изучения строения материалов в машиностроении, в электронной промышленности, в биологии, химии и медицине. Исследование морфологии биологических тканей, в том числе изображение поверхности, формы, определение размеров и границ необходимый этап в анализе современных исследований [3, 9, 10]. Преимущество сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) перед другими методами морфологического исследования заключается в возможности одновременного обзора сравнительно большой поверхности с выявлением топографических особенностей и наблюдением ультратонких деталей организации различных тканевых и клеточных элементов.
Из существующих на сегодняшний день методов ортопедического удлинения дистракционный остеосинтез по Г.А. Илизарову получил международное признание и широкое внедрение в практику, однако вплоть до настоящего времени при его применении остаётся нерешённой проблема функциональной реабилитации пациентов – в частности, восстановление объёма движений в суставах [1, 6]. При дистракционном остеосинтезе в суставах смежных с удлиняемым сегментом методами световой микроскопии и биохимическими методами были выявлены деструктивные изменения хрящевой выстилки [4, 7, 8].
Волокнистая конструкция матрикса суставного хряща методом сканирующей электронной микроскопии подробно описана [9, 11]. Однако исследования состояния суставной поверхности и хондроцитов поверхностной зоны хряща с помощью сканирующей электронной микроскопии в обозначенных экспериментальных условиях отсутствуют.
Цель исследования
С помощью сканирующей электронной микроскопии изучить состояние суставной поверхности и хондроцитов поверхностной зоны хряща наружного мыщелка бедра при удлинении голени у собак.
Материалы и методы исследования
Исследован суставной хрящ наружного мыщелка бедренной кости 14 собак – 5 интактных (контроль) и 9 опытных, которым после закрытой флексионной остеоклазии проводили удлинение голени в ручном режиме с темпом 1 мм за 8 приемов (эксперимент выполнен д.м.н. С.А. Ерофеевым). Содержание, оперативные вмешательства и эвтаназию животных передозировкой барбитуратов проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказы №755 МЗ СССР от 12.08.1977г., №1179 МЗ СССР от 10.10.1983г., №267 МЗ РФ от 19.06. 2003г.) и принципами Европейской конвенции (г. Страсбург, 1986). Манипуляции, проводимые на животных, рассмотрены и одобрены этическим комитетом «РНЦ «ВТО» им. академика Г.А. Илизарова». Исследование проводили через 28 дней дистракции, 30 дней фиксации, 30 дней после снятия аппарата. Визуально оценивали состояние суставных поверхностей.
Для сканирующей электронной микроскопии вскрывали коленный сустав и с передней поверхности наружного мыщелка бедра вырезали кусочки суставного хряща размером 2-3 х 5-6 мм. Затем материал обрабатывали по разработанному нами способу [5]. Фиксированные в альдегидном фиксаторе кусочки промывали в дистиллированной воде, затем материал дегидратировали в спиртах, пропитывали в камфене (3,3–диметил-2-метиленбицикло [2, 2 ,1] гептан), высушивали на воздухе, напыляли алюминием, медью или серебром в вакуумном напылителе «JEE-4 Х/5 В» (Eiko, Япония) и ионном напылителе «IB-6» (Eiko, Япония) и изучали в сканирующем электронном микроскопе «JSM-840» (Jeol, Япония). Для описания топографической картины поверхности клеток использована классификация рельефных образований клеточной поверхности [2].
Результаты исследования и их обсуждение
При исследовании суставного хряща интактных животных макроскопически отмечали блестящие гладкие суставные поверхности жемчужно-белого цвета. При изучении в СЭМ рельеф поверхности суставного хряща имел регулярную волнистость (рис. 1, А) и соответствовал описанной в литературе интактной суставной поверхности мыщелков бедренной кости [9]. При исследовании суставной поверхности на больших увеличениях были обнаружены лакуны без клеток, при этом очаги разволокнения не выявлены (рис. 2, А).
У экспериментальных животных к концу периода дистракции суставной хрящ макроскопически был матовый, по боковым поверхностям мыщелков определялись эрозии. При исследовании с помощью СЭМ обнаружены участки со вскрытыми лакунами, часть из них не содержала клеток (рис. 1, Б). Через месяц фиксации голени в аппарате рельеф суставной поверхности наружного мыщелка бедра имел аномальную структуру. Отмечались очаги деструкции поверхностной зоны с разволокнением подлежащего коллагенового каркаса. У обнаженной суставной поверхности лакуны хондроцитов были вскрыты, среди них много пустых лакун (рис. 1, В). Через месяц после снятия аппарата отмечали гладкие суставные поверхности жемчужно-белого цвета. При исследовании в СЭМ деструкция суставной поверхности наружного мыщелка бедра была выражена в меньшей степени, чем на предыдущих этапах эксперимента. Определялись обширные участки с регулярной волнистостью, уменьшены частота встречаемости и объем участков разволокнения, выявлены участки, в которых были отмечены вскрытые клеточные лакуны, как пустые, так и с хондроцитами (рис. 1, Г).
Исследование поверхностной зоны суставного хряща с помощью СЭМ показало, что в контроле (у интактных животных) хондроциты имели узко- продолговатую форму (рис. 2, Б), микрорельеф клеточной поверхности складчатый, краевые микроворсины немногочисленны, клетки располагались в четко выраженных лакунах, вытянутых по направлению хода волокон (рис. 2,Б).
Для опытов с удлинением голени в неповрежденных участках суставной поверхности в более глубоких слоях поверхностной зоны были характерны хондроциты сферической формы (рис. 2 В, Г), причём наиболее часто такие формы встречались на этапе фиксации голени в аппарате. Хондроциты были увеличены в размерах и занимали всю клеточную лакуну. Поверхность таких клеток имела смешанный тип микрорельефа, состоящего из складок и краевых микроворсинок, которые участвовали в формировании контакта с межклеточным веществом (рис. 2, В), отмечены хондроциты с пузырчатым типом микрорельефа (рис. 2, Г).
Известно, что по характеру и развитию органелл клетки поверхностной зоны хряща в норме относят к высокодифференцированным, но малоактивным хондроцитам, выполняющим роль механоцитов [9]. Форма и микрорельеф хрящевых клеток поверхностной зоны интактных животных, вероятно, обусловлены выполняемой функцией.
В условиях эксперимента выявлено разволокнение суставной поверхности. Известно, что разволокнение межклеточного вещества хряща происходит при уменьшении содержания протеогликанов. Хондроцит обладает значительной чувствительностью к содержанию протеогликанов в окружающем матриксе и быстро реагирует на их изменение [9, 12, 13].
Увеличение размеров хондроцитов в неповрежденных участках поверхностной зоны, изменение их формы и рельефа клеточной поверхности свидетельствовало об усложнении структуры хрящевых клеток и повышении их функциональной активности в условиях эксперимента.
А 
Б
В 
Г
Рис. 1. Суставная поверхность наружного мыщелка бедра собаки. СЭМ. А – контроль. Увеличение 1100. Б – 28 суток дистракции. Увеличение 500. В – 30 суток фиксации. Увеличение 370. Г – 30 суток без аппарата. Увеличение 650
А 
Б
В 
Г
Рис. 2. Поверхностная зона суставного хряща наружного мыщелка бедра собаки, СЭМ. А – контроль, пустая лакуна. Увеличение 2300. Б – контроль, хондроцит имеет складчатый тип микрорельефа. Увеличение 8500. В – 30 суток фиксации, хондроцит имеет смешанный тип микрорельефа, состоящего из складок и микроворсинок, многочисленные отростки (О) контактируют со стенкой лакуны. Коллагеновые фибриллы лакуны (Кф). Увеличение 4300. Г – 30 суток фиксации, хондроцит имеет пузырчатый тип микрорельефа. Увеличение 4500
Заключение
Изменение рельефа суставной поверхности наружного мыщелка бедра при дозированном удлинении голени вызвано деструкцией поверхностной зоны хряща. Степень выраженности изменений и их дискретность по суставной поверхности отражают степень травматичности применяемого режима дистракции. Полученные с помощью СЭМ данные о состоянии суставного хряща необходимо учитывать в клинике с целью предупреждения развития в нем патологического процесса.