Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Общеизвестна закономерность, открытая профессором Г.А. Илизаровым, о стимулирующем влиянии дозированного напряжения растяжения на морфогенез костной и параоссальных тканей [1]. В процессе формирования костного регенерата в нем образуется «зона роста», от которой идет рост тканей в противоположных направлениях. Эта закономерность роста под влиянием дистракции характерна для кости, кожи, сосудов, нервов, мышц. Предложенный Г.А. Илизаровым аппарат внешней фиксации позволяет уравновешивать значение биологических и механических факторов, создавая оптимальное их сочетание. В результате в кратчайшие сроки нормализуется крово- и лимфообращение в конечности, которая начинает выполнять обычные функциональные нагрузки [4].

Исследования ангиогенеза и поиск факторов, влияющих на него, были начаты J. Folkman в середине 70-х годов XX века, позднее им были выделены белковые ангиогенные факторы, стимулирующие рост кровеносных сосудов различного калибра. Известно несколько десятков таких факторов, из которых наиболее обсуждаемыми являются фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста фибробластов (FGF) и ангиогенин (ANG). В ряде исследований показана роль этих факторов в неоангиогенезе, возникающем в ответ на гипоксию тканей [1, 17, 29]. Наиболее интересным представляется комплексное применение реконструктивных сосудистых операций, направленных на восстановление магистрального кровотока с генно-инженерными методами стимуляции ангиогенеза, направленных на развитие микроциркуляторного русла и улучшения перфузии дистальных отделов тканей [2, 6, 28]. Установлено, что в условиях дистракции усиливается ангиогенез за счёт напряжения растяжения в костной ткани [30], новообразование микрососудов необходимо для формирования костных трабекул в процессе дистракционного остеосинтеза [16]. Показано, что остеогенез при дистракции стимулирует ангиогенез в прилежащих мышцах [24], развитие сосудов в процессе дозированного удлинения идёт путём последовательного внутримышечного артериогенеза вслед за внутрикостным ангиогенезом [21]. В различных адаптационных и патологических процессах морфологические и количественные изменения сосудов отмечены многими исследователями [3, 22, 20]. Работами, проведенными в РНЦ «ВТО» им. академика Г.А. Илизарова, выявлены морфофункциональные изменения в тканях при удлинении конечностей в эксперименте [4, 5]. Вместе с тем, ультраструктурно-стереометрические исследования эндотелия капилляров мышц немногочисленны [7]. Выявлены ультраструктурные особенности кровеносных капилляров большеберцовой мышцы удлиняемой голени, свидетельствующие о различных механизмах адаптации сосудистого эндотелия к дистракции в различных ритмах [11]. Сравнительный анализ капилляров эндомизия опытной и противоположной конечностей при дистракции в классическом режиме не проведен, что послужило поводом для данной работы.

Цель работы – морфологический и ультраструктурно-стереометрический анализ капилляров эндомизия передней большеберцовой мышцы голени в условиях дистракционного остеосинтеза с 4-кратной дробностью.

Материалы и методы исследования

В опытах на 8 взрослых беспородных собаках исследовали капилляры эндомизия передней большеберцовой мышцы обеих конечностей. Через 5 дней после закрытой флексионной остеоклазии берцовых костей начинали дозированное удлинение правой голени по 1,0 мм в день с 4-кратной дробностью, эксперименты выполнил д.м.н. С.А. Ерофеев. Все манипуляции на животных, их содержание и выведение из опыта проводили согласно приказу № 755 от 12.08.77 г. МЗ СССР: «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» и Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных целей (Страсбург, 1986). Эвтаназию осуществляли передозировкой барбитуратов через 28 дней дистракции и месяц фиксации. Фрагменты передней большеберцовой мышцы оперированной и контралатеральной (условный контроль) конечностей иссекали в проекции костного регенерата, фиксировали в 2 % растворе глутарового параформальдегида (рН 7,4) с добавлением 0,1 % пикриновой кислоты, постфиксировали в 1 % растворе тетраоксида осмия, после обезвоживания и пропитки заключали в эпоксидные смолы. Используя ультратом ”Nova” (Швеция), изготавливали поперечные ультратонкие срезы, которые контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по R. Reynolds [10]. Исследовали посредством трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100B при стандартном увеличении х11800. Изображения капилляров посредством фотоувеличителя совмещали с тестовой решеткой коротких отрезков, получая стандартное увеличение 44840, определяли: 1) число пересечений тестовой линии с контуром люминальной поверхности эндотелия капилляров (число единиц площади люминальной поверхности капилляра, Тл, усл. ед.); 1) долю объёма, занимаемую цистернами гранулярного эндоплазматического ретикулума (ГЭР) и 2) митохондрий (Мтх) в объёме всего эндотелия (объемная плотность VVгэр, VVмтх, %); 3) долю объёма, приходящуюся на люминальные (люм.), базальные (баз.) и цитоплазматические (цит.) микропиноцитозные везикулы в объёме всего эндотелия (объемная плотность VVлюм., VVбаз., VVцит. везикул, %); 6) число пересечений тестовой линии с контурами межклеточных контактов (МКК) эндотелиоцитов в объёме всего эндотелия (поверхностная плотность SVмкк, усл. ед.) [6]. Достоверность различий определяли на основании критерия Вилкоксона и рандомизации компонент для независимых выборок [8, 9].

Результаты исследования и их обсуждение

Исследованные капилляры соматического типа, эндотелий с непрерывной базальной мембраной [12]. Безъядерные отделы эндотелиоцитов истончены, бедны органеллами. В базальном слое капилляров локализуются 1–3 перицита с цитоплазматическими отростками (рис. В, Г). Наблюдались резервные капилляры с закрытым просветом, немногочисленными микровезикулами и цистернами эндоплазматической сети в цитоплазме (рис. Б). Люминальная поверхность эндотелиальных клеток образует цитоплазматические выросты, выпячивания внутрь просвета, чаще в зоне межклеточных контактов (рис. В, Г), что может свидетельствовать о реактивно изменённых, а так же функционально активных капиллярах. Высокий эндотелий, многочисленные цитоплазматические выросты характерны и для растущих капилляров (рис. В) [4, 5]. Микропиноцитозная система эндотелиоцитов выражена хорошо, диаметр везикул варьирует, что может зависеть как от транспортных свойств эндотелия, так и от уровня прохождения среза. Эндотелиоциты капилляров с профилями ядер бобовидной, элипсоидной, лопастной формы в поле зрения попадали изредка.

Площадь люминальной поверхности эндотелиальных клеток капилляров эндомизия достоверно не отличается в ипсилатеральной и противоположной конечностях, как в конце периода дистракции, так и через месяц фиксации голени в аппарате (таблица). Значения параметра существенно снижаются по окончанию периода фиксации, как в оперированной, так и в контралатеральной конечностях, составляя 58 % и 47 %, соответственно.

Гранулярный эндоплазматический ретикулум (ГЭР) представлен цистернами различной протяженности, чаще короткими, с тонковолокнистым содержимым средней электронной плотности. В конце периода дистракции относительный объём ГЭР в опыте и контроле не отличается достоверно (таблица).

Капилляры эндомизия передней большеберцовой мышцы: (А), (Б) Капилляры в конце периода дистракции. (В), (Г) Реактивно изменённые капилляры после месяца фиксации голени в аппарате: многочисленные люминальные выросты (стрелки), перициты (короткие стрелки). (А) Функционирующий капилляр: микропиноцитозные везикулы (стрелки), зоны межклеточных контактов (короткие стрелки). (Б) Резервный капилляр с суженным просветом (стрелка), цистерны эндоплазматического ретикулума (короткие стрелки). Электронограммы, увеличение 11800х

Стереологические параметры капилляров эндомизия передней большеберцовой мышцы

Примечание: Жирным шрифтом выделены значения параметров, достоверно отличающихся относительно предыдущего срока исследования; подчёркнуты достоверные различия между опытной и к/латеральной конечностями.

Через месяц фиксации данный параметр в оперированной конечности составляет 194 % от значения контралатеральной (Р < 0,05), увеличиваясь относительно предыдущего срока исследования и составив 170 % (Р < 0,05).

Митохондрии округлые, реже овальные, различных размеров. Объёмная плотность этих органелл в эндотелиоцитах капилляров через месяц дистракции в оперированной конечности составляет 228 % от значения в контралатеральной (Р < 0,05). Через месяц фиксации данный параметр в капиллярах обеих конечностей снижается почти вдвое относительно предыдущего срока опыта, составив, соответственно, 51 % и 55 % (Р < 0,05). При этом относительный объём митохондрий опытной конечности составляет 181 % от объёма условно контрольной (Р < 0,05).

Зоны межклеточных контактов разнообразной формы – от подковообразных стыков до зигзагоподобных сложных терминальных «засовов». Поверхностная плотность зон межклеточных контактов в эндотелиальных клетках капилляров через месяц дистракции в оперированной конечности составляет 69 % от значения в контралатеральной (Р < 0,05). Через месяц фиксации голени в аппарате параметр значительно уменьшается в обеих конечностях, составив 57 % и 46 %, соответственно, от значений в периоде дистракции. При этом в опытной конечности, аналогично предыдущему сроку, SVмкк несколько меньше по сравнению с контролем (85 %).

В результате проведенного ультраструктурно-стереологического анализа были выявлены количественные отличия в организации эндотелия кровеносных капилляров эндомизия передней большеберцовой мышцы удлиняемой голени и контралатеральной. Функциональное значение межклеточных контактов – регуляция проницаемости капилляров и повышение адгезивных свойств эндотелиоцитов [13]. Предполагают, что сосудодвигательные реакции передаются путем электротонических потенциалов, формирующихся в области межклеточных контактов гладкомышечных и эндотелиальных клеток [26]. Очевидно, что большая протяженность зон межклеточных контактов эндотелия контралатеральной конечности в периоде дистракции объясняется значительно возрастающей нагрузкой, повышая потребность в адгезии эндотелиоцитов, необходимостью усилить вазоконстрикторные (вазодилататорные) реакции микрососудов. Через месяц фиксации голени в аппарате значение параметра на опытной и противоположной конечностях существенно не отличались.

Объёмная плотность ГЭР и митохондриального аппарата в эндотелии удлиняемой голени свидетельствовали об интенсивном биосинтезе и ускорении окислительно-восстановительных процессов, что объясняется рядом причин. Наряду с главной функцией – транскапиллярным обменом, эндотелиоциты модулируют рост, метаболизм, функцию гладкомышечных клеток, секретируя вазоактивные вещества, наиболее важные из которых простациклин и эндотелиальный релаксирующий фактор [15]. При этом выделение вазоактивных веществ может стимулироваться как эндогенными веществами (ацетилхолином, аденозинтрифосфатазой, брадикинином), так и биофизическими условиями кровообращения (низкое напряжение кислорода, пульсовое растяжение сосудистой стенки, повышение вязкости крови). Обозначенные биофизические условия с большой вероятностью имеют место при дистракции. Эндотелиальные клетки также синтезируют сильнодействующий вазоконстрикторный пептид – эндотеллин, участвуют в образовании тканевых мукополисахаридов, фибринолитических факторов, гистамина [21]. Факторы роста и цитокины, синтезируемые эндотелиоцитами именно капилляров, существенно влияют на другие клетки сосудистой стенки более крупных сосудов, так как представительство эндотелия капилляров значительно выше по сравнению с крупными сосудами: на 1 мм2 мышечной ткани у собаки приходится 2630 капилляров [12]. В данной работе не представляется возможным конкретизировать, какие именно факторы синтезируются эндоплазматическим ретикулумом эндотелиоцитов, но можно предположить, что в условиях дистракции увеличивается потребность в синтезе выше обозначенных факторов и через месяц фиксации эта потребность не снижается.

В условиях дистракции, как известно, активизируются процессы ангиогистогенеза [4, 5], критическим фактором, влияющим на ангиогенез, является регионарная ишемия тканей организма. При этом возрастает количество специфических рецепторов на поверхности клеток кровеносных сосудов [14, 25], активируется взаимодействие АФР с ними и увеличивается их продукция, что приводит к активации перицитов, фибробластов и клеток эндотелия, деградирует базальная мембрана сосудов, происходит миграция и пролиферация активированных клеток, формируется просвет нового сосуда и новая базальная мембрана, появляется новая капиллярная петля. Другим биологическим эффектом факторов роста является торможение апоптоза эндотелиальных клеток, приводящее к продлению сроков их функционирования [22, 23]. Скорость неоваскуляризации составляет от 0,23 до 0,8 мм/сут [19].

Таким образом, выявлены количественные отличия в организации эндотелия кровеносных капилляров эндомизия передней большеберцовой мышцы удлиняемой голени и условно контрольной, свидетельствующие о повышенной нагрузке на контралатеральную конечность в период дистракции и активизации гематканевого обмена лишь в периоде фиксации. Опытная конечность в ходе эксперимента отличалась существенным увеличением биосинтетической и метаболической активности эндотелиальных клеток кровеносных капилляров.