Этиология ВЗК остается до конца неизвестной. Патогенез заболеваний представляет собой процесс крайне сложного и комплексного взаимодействия различных патофизиологических механизмов аутоиммунного воспаления, развивающихся на фоне генетической предрасположенности к неадекватному иммунному ответу как со стороны иммунной системы организма в целом, так и локальной иммунной системы ЖКТ в частности [4, 9].
К настоящему моменту в научной среде сформировался устойчивый интерес к роли фибробластов при этом заболевании. По современным представлениям, они могут претендовать на роль ключевых клеток при БК, и от спектра продуцируемых ими компонентов во многом зависит дальнейшее течение болезни, направление на репарацию или обострение, длительность ремиссии [3]. Одним из возможных путей скрининга веществ, продуцируемых клеткой, является времяпролетная хроматография, позволяющая провести спектральный анализ «секретома» клеток. В настоящее время спектр белков стал самостоятельным объектом исследования, так называемой «молекулярной сигнатурой» или «штрих-кодом», не требующим индивидуальной идентификации. Понятие о молекулярной сигнатуре возникло относительно недавно в качестве альтернативного направления протеомного анализа и активно развивается.
Целью нашего исследования стало выявление особенностей белкового спектра культуральной жидкости, полученной при многократном культивировании фибробластов в норме и патологии.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования являлась культуральная жидкость культур фибробластов, полученных из биоптатов кожи четырех условно здоровых и трех детей с болезнью Крона в возрасте 14–17 лет. Диагноз ставили на основании комплексного обследования, включающего в себя клинико-лабораторные данные, а также эндоскопическое обследование слизистой оболочки кишечника с морфологическим анализом биоптатов. Протокол обследования был одобрен этическим комитетом. У всех детей и их родителей было получено информированное согласие на участие в исследовании. Фибробласты культивировали до 5 пассажей в среде ДМЭМ с 10 % эмбриональной телячьей сывороткой и антибиотиками (25 000 ед. пенициллина и 25 000 мкг стрептомицина), дополненной L-глютамином (150 мг) в культуральных флаконах объемом 75 см2 при 37 °С в атмосфере с 5 % СО2 согласно стандартному протоколу. Фенотип клеток определялся на проточном цитофлюориметре BD FACS Canto II (Becton, Dickinson and Company, США) с помощью набора для идентификации мезенхимальных клеток Human MSC Analysis Kit (США). Определялась экспрессия CD73, CD90, CD105, CD44, CD13; в качестве негативного контроля использовались CD11b, CD19, CD34, CD45, HLA-DR.
После каждого пассажа культуральную жидкость отбирали и определяли белковый спектр. Масс-спектры (диапазон масс от 1000 до 17000 Да) были получены на масс-спектрометре MALDI MS Autoflex III TOF/TOF (Bruker Daltonics, США), работающем в положительном линейном режиме. Калибровка масс-спектрометра осуществлялась с помощью белковых стандартов (Peptide Calibration Standard и Protein Calibration Standard II, «Bruker Daltonics»).
По каждому спектру был получен масс-лист с указанием отношения массы к заряду (m/z) каждого пика, его площади и интенсивности (ClinProTools 2.1 software («Bruker Daltonics»)). Эти данные экспортировали в таблицы MS Excel, и значения площадей в повторных измерениях усредняли.
Данные масс-листов были сгруппированы в кластеры. Кластеризация проводилась на основании сходства молекулярных весов. Количество протеиновых фрагментов во всех кластерах масс-спектра культуральной жидкости каждого пассажа принималось за 100 % , в каждом кластере подсчитывался процент содержания белковых фрагментов от общего количества в масс-спектре.
Полученные данные обрабатывались с помощью пакета прикладных программ «Graph Pad Prism 6.0». Для определения статистической значимости выявленных различий использовался критерий Тьюкей. Различия считались достоверными при P ≤ 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
К настоящему моменту в научной среде сформировался устойчивый интерес к роли фибробластов при болезни Крона. Фибробласты как «сторожевые клетки», «резидентные охранники» могут играть свою негативную роль, являясь проводниками и источниками сигналов, стимулирующих воспалительную реакцию [3, 7]. С другой стороны, обладая уникальным потенциалом к дифференцировке и являясь продуцентами целого спектра биологически активных веществ, эти клетки могут и должны способствовать выздоровлению и длительной ремиссии [6].
Анализ результатов фенотипирования клеточных культур от всех пассажей не показал статистически значимой разницы в экспрессии клеточных маркеров между больными и условно здоровыми детьми. Начиная с пассажа «А», клеток, экспрессирующих маркеры CD11b, CD19, CD34, CD45, HLA-DR, в исследуемых образцах обнаружено не было. Результаты фенотипирования по маркерам CD73, CD90, CD105, CD44, CD13 приведены в таблице.
Сравнение CD фенотипов фибробластов условно-здоровых детей и детей с болезнью Крона в ходе последовательного пассирования
|
Маркер |
Дети |
Пассаж А |
Пассаж Б |
Пассаж В |
Пассаж Г |
Пассаж Д |
|
CD90 |
Здоровые |
84,13 ± 1,84 |
94,77 ± 2,19 |
94,37 ± 1,90 |
95,27 ± 2,91 |
84,03 ± 7,31 |
|
Бк |
95,20 ± 3,19 |
89,33 ± 4,80 |
80,83 ± 10,75 |
88,45 ± 6,68 |
92,65 ± 3,95 |
|
|
CD44 |
Здоровые |
97,77 ± 1,05 |
98,27 ± 0,72 |
97,43 ± 2,57 |
96,63 ± 3,27 |
97,13 ± 1,53 |
|
Бк |
95,58 ± 1,58 |
97,40 ± 1,41 |
95,63 ± 1,74 |
96,60 ± 2,27 |
99,80 ± 0,12 |
|
|
CD105 |
Здоровые |
41,50 ± 3,57 |
55,77 ± 4,04 |
49,43 ± 6,67 |
70,60 ± 5,75 |
90,73 ± 0,59 |
|
Бк |
58,63 ± 3,43 |
86,63 ± 2,16 |
55,55 ± 4,33 |
90,78 ± 3,53 |
92,78 ± 1,07 |
|
|
CD73 |
Здоровые |
95,53 ± 4,22 |
99,83 ± 0,17 |
97,57 ± 1,37 |
98,87 ± 0,94 |
99,23 ± 0,62 |
|
Бк |
99,80 ± 0,12 |
99,93 ± 0,02 |
98,08 ± 0,61 |
97,20 ± 1,77 |
97,93 ± 1,04 |
|
|
CD13 |
Здоровые |
93,60 ± 3,00 |
90,13 ± 8,47 |
95,10 ± 4,25 |
93,43 ± 6,32 |
93,20 ± 6,55 |
|
Бк |
93,08 ± 6,47 |
91,73 ± 4,62 |
93,03 ± 2,48 |
96,50 ± 0,87 |
94,80 ± 1,93 |
Для определения исходного уровня протеинов в культуральной жидкости нами была проведена спектрометрия среды для культивирования. По результатам анализа масс-спектра среды для культивирования были выделены 5 перекрывающихся зон с наибольшей концентрацией белковых фрагментов (далее кластеры): кластер 1 – от 0,8 кДа до 3,3 кДа; кластер 2 – от 3,3 кДа до 6,00 кДа; кластер 3 – от 6 кДа до 11 кДа; кластер 4 – от 11 кДа до 16,6 кДа; кластер 5 – более 16,6 кДа.
При сравнительном анализе протеинового профиля интактной среды для культивирования и культуральной жидкости мы получили критерии оценки метаболической активности клеток. Так как содержание протеиновых фрагментов в интактной среде априори величина постоянная и колебаться может лишь в незначительных пределах, мы предположили, что только активность клеток может изменять этот показатель. Если процент протеиновых фрагментов культуральной жидкости в каком-либо кластере превышает аналогичный параметр по интактной среде – клетки, по нашему мнению, синтезируют компоненты в среду в означенном масс-спектральном диапазоне, в противоположной ситуации – используют.
Сравнительный анализ культуральной жидкости фибробластов условно-здоровых детей от различных пассажей (рис. 1) показал, что в пассаже А статистически значимой разницы между показателями среды и культуральной жидкостью не было, что можно объяснить относительно низкой метаболической активностью клеток в адаптационном периоде. Активность клеток в пассажах Б, В, Г и Д была значительно выше, причем в кластерах 1 и 5 было зарегистрировано превышение над показателями среды: в пассаже В (p = 0,03) и Г (p = 0,04) – кластер 1 и пассаж Б (p = 0,04), В (p = 0,03) и Д (p < 0,02). В кластерах 2, 3, 4 протеиновых фрагментов было зарегистрировано меньше, чем в интактной среде (p < 0,03).
Рис. 1. Содержание протеиновых фрагментов в культуральной жидкости культур фибробластов условно здоровых детей
Анализ культуральных жидкостей культур фибробластов детей с болезнью Крона (рис. 2) показал, что клетки проявляют повышенную активность в продукции компонентов уже в пассаже А в кластере 1 (p = 0,03). В пассажах Б, В и Д превышение над показателями среды было зафиксировано только в кластере 5 (p < 0,05).
Рис. 2. Содержание протеиновых фрагментов в культуральной жидкости культур фибробластов детей с болезнью Крона
В 3 и 4 процент протеиновых фрагментов был значительно ниже в интактной среде (p < 0,03).
Приведенные соотношения привели нас к мысли о возможных различиях между протеиновыми профилями культуральных жидкостей детей с болезнью Крона и условно здоровых детей. Для проверки этой гипотезы был проведен сравнительный анализ протеиновых профилей культуральных жидкостей детей с болезнью Крона с протеиновыми профилями культуральных жидкостей условно здоровых детей (рис. 3).
В пассаже А статистически значимых различий в протеиновых профилях больных и условно здоровых выявить не удалось. В пассаже Б значения коэффициента больше единицы зафиксированы в кластере 3 (p = 0,04), в пассажах В и Г статистически значимые различия обнаружены в кластерах: 2 (p = 0,04 только в пассаже Г), 3 (p = 0,04 в обеих выборках) и 4 (p = 0,02 и p < 0,02 соответственно), в пассаже Д статистически значимых различий нами обнаружено не было. Подобную разницу в метаболической активности можно объяснить активным участием фибробластов в патологических процессах. По данным других авторов, метаболический профиль клеток (т.е. спектр и активность продукции ими различных веществ) может меняться под воздействием различных факторов и патогенов. Так, например, в условиях инсулинорезистентности и гипергликемии, наиболее характерных для сахарного диабета второго типа, фибробласты трансформируются в своих предшественников и начинают бесконтрольно синтезировать коллаген, эластин, протеогликаны и другие компоненты экстрацеллюлярного матрикса, что приводит к развитию активной перестройки соединительной ткани и изменению сосудистой стенки [2]. Протеиновые профили культур фибробластов меняются и при других патологических состояниях – при пневмонии [8] или вирусной инфекции [5]. Косвенно о внешней природе фактора, влияющего на изменение протеинового профиля фибробластов при патологии, может свидетельствовать тот факт, что к пассажу Д коэффициент отношения протеиновых профилей детей с БК и условно-здоровых приближается к единице. Можно предположить, что в процессе замены культуральной среды при пассировании количество фактора, «стимулирующего» патологическое поведение фибробластов, снижается, и они постепенно возвращаются к нормальному режиму функционирования.
Рис. 3. Отношение процентного содержания протеиновых фрагментов в культуральной жидкости от пациентов с БК к условно-здоровым
Выводы
1. Масс-спектр культуральной жидкости культур фибробластов детей c болезнью Крона имеет характерные особенности, отличающие его от масс-спектра культуральной жидкости культур фибробластов, полученных от условно здоровых детей.
2. Различия между протеомным профилем культуральной жидкости культур фибробластов, полученных от детей с болезнью Крона и от условно здоровых детей, уменьшаются с увеличением сроков культивирования.
3. Молекулярные сигнатуры культуральной жидкости отличаются от масс-спектров интактной культуральной среды, что может быть использовано для характеристики активности культур фибробластов на разных этапах культивирования.