Одним из наиболее перспективных направлений медико-биологических исследований является использование метода масс-спектрометрии для оценки протеома (совокупности белков) в различных биологических субстратах человеческого организма [2, 7]. Протеомика, как самостоятельная наука молода и оформилась в отдельную отрасль знания в конце девяностых годов двадцатого века. Ее развитие явилось следствием завершения международной программы по расшифровке генома человека поскольку генетическая информация может лишь говорить о предрасположенности организма к тем или иным заболеваниям, а изучение изменения протеома позволяет выявлять заболевания на ранних стадиях их возникновения. В настоящее время основное внимание исследователей приковано к проблемам диагностики онкологических заболеваний, гораздо менее изучается протеом при других видах патологий и практически отсутствуют данные у детей.
Патология верхних отделов пищеварительного тракта в структуре детской заболеваемости занимают первое место. Среди гастроэнтерологических заболеваний одной из самых распространенных нозологических форм является гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь (ГЭРБ). Несмотря на многочисленность работ по изучению этиологии, патогенеза, способов и особенностей лечения этих заболеваний нельзя сказать, что эти вопросы в целом (и ГЭРБ в частности) окончательно решены, особенно у детей [1, 3, 4]. Важным аспектом при этом является возможность быстрого, неинвазивного и не травматического физически и психологически определения выраженности заболевания и эффективности лечения. Для этих целей, на наш взгляд, перспективным является исследование низкомолекулярного субпротеома сыворотки крови, поскольку многие пептиды являются показателем катаболической активности организма.
В связи с вышеизложенным, нами была предпринята работа, целью которой явилось выявление особенностей низкомолекулярного субпротеома сыворотки крови у детей с ГЭРБ.
Материалы и методы исследования
Были исследованы образцы сывороток крови, полученных от 16 детей обоего пола с диагностированной ГЭРБ, средний возраст обследуемых - 11,8 лет. Контрольную группу составили 15 здоровых детей обоего пола (средний возраст 10,6 лет). От родителей всех детей и этического комитета получено согласие на проведение исследований.
Сыворотки крови пациентов получались стандартным способом. Для последующих масс-спектрометрических исследований образцы подвергались пробоподготовке – обработке с помощью магнитных частиц «Profiling Kit 100 MB-WCX» (Bruker, Германия). Масс-спектры получали на MALDI-TOF масс-спектрометре Bruker Autiflex (Германия). Для нанесения образцов на масс-спектрометрическую мишень использовалась матрица на основе α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, что позволяло выделить в анализируемой пробе сыворотки пептиды и белки в интервале молекулярных масс от 0 до 10000 Дa. Полученные результаты получены в виде масс-листов с указанием величин массы к заряду (m/z) каждого масс-спекрометрического пика, его площади и интенсивности. Полученные данные были разбиты на кластеры (в зависимости от молекулярного веса ) и статистически обработаны при помощи пакета прикладных программ «STATISTICA 6,1».
Результаты исследования и их обсуждение
Данные по анализу низкомолекулярного субпротеома сыворотки крови детей с ГЭРБ представлен в табл. 1.
Таблица 1
Основные характеристики масс-листов детей с ГЭРБ
|
Кластеры |
Среднее число пиков |
Минимальное число пиков |
Максимальное число пиков |
Среднее значение молекулярного веса (Да) |
Минимальное значение молекулярного веса (Да) |
Максимальное значение молекулярного веса (Да) |
Медиана (Да) |
|
0–1000 Да |
8,7 |
2 |
14 |
848,34 |
800,15 |
975,81 |
838,66 |
|
1000–2000 Да |
14,1 |
6 |
31 |
1540,69 |
1048,48 |
1976,11 |
1564,04 |
|
2000–3000 Да |
8,5 |
5 |
18 |
2651,45 |
2006,38 |
2992,24 |
2741,29 |
|
3000–4000 Да |
9,8 |
6 |
13 |
3456,73 |
3015,19 |
3982,60 |
3279,20 |
|
4000 – 5000 Да |
13,1 |
7 |
18 |
4310,02 |
4053,93 |
4966,40 |
4224,49 |
|
5000–6000 Да |
7,6 |
4 |
11 |
8686,42 |
5064,79 |
5988,19 |
5805,33 |
|
6000–7000 Да |
5,6 |
2 |
11 |
6511,21 |
6051,12 |
6787,52 |
6588,26 |
|
7000–8000 Да |
2,5 |
1 |
5 |
7601,78 |
7020,49 |
7927,68 |
7762,75 |
|
8000–9000 Да |
5,9 |
2 |
13 |
8718,25 |
8140,69 |
8984,28 |
8730,15 |
|
9000–10000 Да |
6,6 |
5 |
11 |
9329,73 |
9059,66 |
9520,83 |
9346,52 |
Из представленных данных следует, что в интервале m/z от 0 до 10000 Да у детей с ГЭРБ в среднем всего 82,4 масс-спектрометрических пика. Минимальное число пиков у больных детей отмечено в интервалах m/z от 7000 до 8000 и от 8000 до 9000 Да. Максимальное количество пиков отмечено в интервале m/z от 1000 до 2000 Да – 31 масс-спектрометрический пик.
Проведенный анализ средних значений m/z масс-спектрометрических пиков в различных кластерах ( в интервалах масс от 0 до 1000, от 1000 до 2000 и от 5000 до 6000 Да) в 30 % случаев выявил достоверные различия в величине показателя между детьми с ГЭРБ и здоровыми детьми. Эта разница свидетельствует о различиях в представленности различных низкомолекулярных белков и пептидов в этих интервалах масс. Аналогичные данные были получены в исследованиях желудочного сока у взрослых пациентов, в результате которых установлено, что имеются четкие различия паттернов масс-спектров у образцов от здоровых людей и пациентов с заболеваниями желудка.[7]. Результаты, полученные в ходе анализа масс-спектров в анализируемых группах, позволили произвести поиск низкомолекулярных белков и пептидов, представленных в этих группах с максимальными различиями (табл. 2).
В таблицу включены лишь те пептиды и низкомолекулярные белки, при исследовании которых выявлены различия в изучаемых группах.
Анализ представленных в таблице данных свидетельствует о том, что выявлено 18 пептидов и 3 низкомолекулярных белка сыворотки крови, представленных только в группе здоровых детей (с процентом представленности – не ниже 25 %) и 14 пептидов и 4 низкомолекулярных белка, представленных только у больных детей.
Следует особо отметить, что наибольшая разница в уровне представленности отмечена для пептидов. При этом определены пептиды, характерные лишь для здоровых детей: так пептид 925 Да отмечен у 93,3 % здоровых и полностью отсутствовал в группе детей с ГЭРБ; пептид 909 Да отмечен у 87 % здоровых детей и полностью отсутствует у больных, пептид 893 Да встречается в 93,3 % образцах сыворотки крови, полученных от здоровых детей и в 6,3 % аналогичных образцов, полученных от детей, больных ГЭРБ. Пептиды m/z 2046 и 2669 Да встречаются так же преимущественно у здоровых детей и гораздо менее представлены у больных (80 % и 19 %; 87 % и 25 % соответственно). Количество пептидов, характерных для детей с ГЭРБ гораздо меньше – их найдено всего два: пептид 1564 Да отмечен у 50 % больных детей и у 0 % здоровых и пептид 907 Да отмечен у 62 % и 13 % соответственно. Полученные нами данные подтверждают мнение о том, что подобные протеомные исследования могут иметь большое значение для клинических исследований [6].
Таблица 2
Данные сравнительного анализа низкомолекулярного субпротеома сыворотки крови у здоровых детей и детей с ГЭРБ
|
Молекулярный вес (Да) |
Представленность у больных |
Представленность у здоровых |
Молекулярный вес (Да) |
Представленность у больных |
Представленность у здоровых |
||||
|
Чел. |
% |
Чел. |
% |
Чел. |
% |
Чел. |
% |
||
|
811 |
8 |
50 |
1 |
6,7 |
2954 |
4 |
25 |
0 |
0 |
|
814 |
7 |
44 |
0 |
0 |
3208 |
0 |
0 |
6 |
40 |
|
834 |
6 |
38 |
1 |
6,7 |
3218 |
4 |
25 |
0 |
0 |
|
837 |
4 |
25 |
0 |
0 |
3279 |
3 |
19 |
11 |
73,3 |
|
845 |
5 |
31,3 |
0 |
0 |
3317 |
4 |
25 |
0 |
0 |
|
850 |
1 |
6,3 |
7 |
46,7 |
4153 |
1 |
6,3 |
6 |
40 |
|
865 |
1 |
6,3 |
8 |
53 |
4193 |
4 |
25 |
0 |
0 |
|
877 |
2 |
12,5 |
13 |
86,7 |
4169 |
0 |
0 |
6 |
40 |
|
878 |
8 |
50 |
0 |
0 |
4196 |
0 |
0 |
4 |
26,7 |
|
893 |
1 |
6,3 |
14 |
93,3 |
4224 |
7 |
44 |
0 |
0 |
|
907 |
10 |
62,5 |
2 |
13,3 |
4226 |
1 |
6,3 |
8 |
53,3 |
|
909 |
0 |
0 |
13 |
86,7 |
4248 |
4 |
25 |
10 |
67 |
|
925 |
0 |
0 |
14 |
93,3 |
4283 |
0 |
0 |
4 |
26,7 |
|
931 |
0 |
0 |
5 |
33,3 |
4304 |
0 |
0 |
4 |
26,7 |
|
1451 |
4 |
25 |
0 |
0 |
5248 |
0 |
0 |
4 |
26,7 |
|
1472 |
4 |
25 |
0 |
0 |
5354 |
0 |
0 |
7 |
46,7 |
|
1523 |
4 |
25 |
0 |
0 |
5794 |
0 |
0 |
4 |
26,7 |
|
1564 |
8 |
50 |
0 |
0 |
5922 |
0 |
0 |
6 |
40 |
|
1568 |
5 |
31,3 |
0 |
0 |
5926 |
5 |
31,3 |
0 |
0 |
|
1574 |
4 |
25 |
0 |
0 |
5942 |
0 |
0 |
4 |
26,7 |
|
1597 |
5 |
31,3 |
0 |
0 |
5943 |
0 |
0 |
4 |
26,7 |
|
1968 |
0 |
0 |
6 |
40 |
6050 |
0 |
0 |
4 |
26,7 |
|
2022 |
0 |
0 |
4 |
26,7 |
6632 |
2 |
12,5 |
8 |
53,3 |
|
2046 |
3 |
19 |
12 |
80 |
8629 |
1 |
6,3 |
4 |
26,7 |
|
2134 |
0 |
0 |
6 |
40 |
8813 |
4 |
25 |
1 |
6,7 |
|
2669 |
4 |
25 |
13 |
87 |
9327 |
1 |
6,3 |
5 |
33,3 |
|
2755 |
0 |
0 |
4 |
26,7 |
9362 |
2 |
12,5 |
6 |
40 |
|
2926 |
4 |
25 |
0 |
0 |
9419 |
4 |
25 |
0 |
0 |
|
2960 |
0 |
0 |
6 |
4 |
|||||
Заключение
В результате исследования низкомолекулярного субпротеома сыворотки крови у больных с ГЭРБ установлены различия с аналогичными показателями, характерными для здоровых детей.
Выявлены 39 пептидов и низкомолекулярных белков сыворотки крови, присущих преимущественно здоровым или больным детям.
Полученные данные свидетельствуют о наличии особых паттернов (сигнатур) низкомолекулярных белков и пептидов, характерных для сывороток крови детей с ГЭРБ. Полученные результаты свидетельствуют о наличии различий в обмене низкомолекулярных белков и пептидов при ГЭРБ и могут служить основой в разработке малоинвазивной масс-спектрометрической системы как для диагностики ГЭРБ, так и мониторинга состояния больных детей в ходе заболевания.