Одним из наиболее частых и серьезных осложнений сифилиса является вовлечение в инфекционный процесс центральной нервной системы (ЦНС), последствия которого могут быть необратимыми и приводить к стойкой инвалидизации больных и летальным исходам. Инвазия бледной трепонемы в ЦНС происходит на ранних стадиях течения сифилитической инфекции в период гематогенной диссеминации возбудителя. Существенное число случаев нейросифилиса у пациентов, ранее получавших противосифилитическую терапию, свидетельствует о недостаточной санации ЦНС в процессе терапии неневрологического сифилиса. Одной из причин, обусловливающих низкую эффективность лечения, является трудность достижения и поддержания в интратекальном пространстве необходимой концентрации антибактериального препарата. Объективным основанием существования данной проблемы являются анатомо-функциональные особенности ЦНС и свойства лекарственного средства. Пенициллины, сохраняющие лидирующие позиции в лечении сифилиса, не растворимы в жирах и имеют высокую степень связывания с белками крови, что препятствует их проникновению через гемато-ЦНС барьеры, а также имеют сродство к имеющимся физиологическим механизмам активного выведения метаболитов, что в совокупности с регулярным обновлением ЦСЖ препятствует их накоплению внутри ЦНС [1]. Натриевая соль бензилпенициллина признана формой, в наибольшей степени обеспечивающей аккумуляцию антибиотика в пространстве ЦНС [2, 3, 4]. Лечение этим препаратом пациентов с поздними формами сифилиса и состоянием серорезистентности в числе прочих преследует цель достижения эффективной концентрации антибиотика в ЦНС. Однако, сведения о конкретных значениях концентраций создаваемых в ЦСЖ при внутримышечном введении данного препарата ограничены отдельными исследованиями на небольшой выборке [5]. Опубликованные исследования посвящены, в основном, дюрантным препаратам либо внутривенному пути введения бензилпенициллина, Преимущественно данные получены с использованием микробиологических методов исследования, обладающих недостаточной аналитической точностью [6, 7, 8, 9, 10], метод высокоэффективной жидкостной хроматографии применялся в отдельных случаях [11].
Целью настоящего исследования являлось исследование содержания бензилпенициллина натриевой соли в ЦСЖ в процессе терапии пациентов с состоянием серорезистентности и поздними формами сифилиса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Материалы и методы исследования
Были исследованы 30 образцов ЦСЖ пациентов, подвергшихся диагностической люмбальной пункции в связи с подозрением на нейросифилис, и получавших на момент пункции специфическую терапию по поводу состояния серорезистентности (27 человек) и позднего сифилиса (3 человека). Пациенты получали 1 млн. ЕД бензилпенициллина натриевой соли путем внутримышечного введения каждые 4 часа (6 человек) либо каждые 6 часов (24 человека). Все пациенты были проконсультированы неврологом и подписали информированное согласие. Часть ЦСЖ использовали для проведения стандартных тестов, утвержденных приказами МЗ РФ для диагностики нейросифилиса, остатки образцов аликвотировали и хранили при температуре минус 80 °С.
После размораживания проводили депротеинизацию образцов путем преципитации ацетонитрилом, центрифугирование в течение 10 минут при 16000×g и 5 °С, и фильтрацию полученного супернатанта через мембранный фильтр. Анализ образца методом высокоэффективной жидкостной хроматографии производили в изократическом режиме, с использованием в качестве подвижной фазы 20 % ацетонитрила, 80 % раствор дигидрофосфата калия (рН 6,2), со скоростью потока 0,85 мл/мин, и детекцией в УФ (215 нм). Калибровку проводили методом линейной регрессии с использованием внешнего стандарта. Контроль воспроизводимости осуществляли путем использования повторных проб (коэффициент вариации составил 5,67 %). Данный метод позволил снизить предел обнаружения натриевой соли бензилпенициллина до 0,134 нг/мл, при сохранении области линейности 15–129 мкг/л.
Статистический анализ данных проведен согласно общепринятым методам [12] c использованием лицензионной программы Medcalc 12.2 (MedCalcSoftwarebvba, Бельгия). Поскольку распределение показателей не являлось нормальным, данные приведены в виде медианы и границ межквартильного интервала (25–75 квартиль). Сравнительный анализ выполнен с помощью критерия Манн-Уитни. Для долей приведены абсолютное количество и доля с 95 %-доверительным интервалом (95 %ДИ).
Результаты исследования
и их обсуждение
Из 30 пациентов было 18 мужчин и 12 женщин. Возраст пациентов составил 24 до 62 лет, медиана (25–75 % квартиль) – 42 (34–49) года. Длительность заболевания превышала 5 лет.
Все пациенты имели положительные результаты более чем двух трепонемных тестов в крови и 24 имели положительные результаты нетрепонемных тестов. Три пациента не получали ранее лечение по поводу сифилитической инфекции, 27 пациентов имели в анамнезе один и более курс противосифилитической терапии парентеральными препаратами пенициллина длительного, среднего или короткого действия и цефтриаксоном.
У одного пациента диагностирована ВИЧ-инфекция. На наличие в анамнезе черепно-мозговой травмы указывало 8 человек.
При неврологическом обследовании у 13 пациентов были обнаружены те или иные отклонения: нарушение зрения (3 пациентов), слуха (1 пациент), головные боли (2 пациента), нейропсихиатрические нарушения (2 пациента), поражение черепно-мозговых нервов (7 пациентов), нарушения двигательной функции (3 пациента), координаторные расстройства (1 пациент), расстройства походки (1 пациент).
На основании результатов ликворологического исследования нейросифилис был установлен у 2 из 3 пациентов с поздним сифилисом и у 8 из 27 пациентов с состоянием серорезистентности.
К моменту выполнения люмбальной пункции пациенты получали терапию в течение от 1 до 19 дней, медиана (25–75 % квартиль) составила 5,5 (4–11) дней. Время, прошедшее с момента последнего введения антибактериального препарата до забора образца ЦСЖ варьировало от 55 до 295 минут, медиана (25 %–75 % квартиль) равнялась 69 (61–110).
Достигнутые при этом концентрации антибактериального препарата в цереброспинальной жидкости представлены на рисунке.
Общее содержание натриевой соли бензилпенициллина в ЦСЖ находилось в пределах от 4 до 466 мкг/л, медиана (25 %–75 % квартиль) составила 132 (58–241) мкг/л.
При сравнении концентраций у пациентов с установленным и не подтвержденным диагнозом «нейросифилис» достоверных отличий не было выявлено: 193 (112–241) против 126 (56–246), р = 0,724.
Также была проведена оценка содержания натриевой соли бензилпенициллина в ЦСЖ по отношению к концентрациям пенициллина, принятым как «минимальная трепонемацидная концентрация» (18 мкг/л) [13] и максимальная эффективная концентрация (360 мкг/л) [14]. Были получены следующие результаты. В 3 случаях (10 %)
концентрация препарата была ниже 18 мкг/л (4, 8 и 17 мкг/л). Только в 2 случаях содержание антибиотика было выше 360 мкг/л. В большинстве (25/83 %) образцов значения находились в интервале между этими значениями.
Концентрация бензилпенициллина натриевой соли в цереброспинальной жидкости после очередной внутримышечной инъекции 1 млн. ЕД в режиме 4-кратного (○) либо 6-кратного (◊) введения у пациентов, получавших терапию по поводу состояния серорезистентности или позднего сифилиса; черным цветом выделены случаи с диагностированным в результате ликворологического исследования нейросифилисом
Несмотря на то, что для лечения сифилиса пенициллин применяется, начиная с 40-х годов ХХ века, научное обоснование рекомендаций по терапии различных форм заболевания признается недостаточным. К факторам, существенно затрудняющим проведение научных исследований высокого уровня доказательности при сифилисе относят: трудность оценки исхода терапии, необходимость длительных сроков серологического наблюдения, комплексность диагностических критериев при различных формах заболевания, затрудняющая анализ критериев включения и проведение мета-анализа, а также отсутствие заинтересованности фармакологических компаний [15].
В связи с вышеизложенным, в основе доказательной базы обоснования схем терапии при сифилитической инфекции лежат представления о трепонемацидном действии пенициллина, полученные в экспериментальных работах in vitro и in vivo на животных моделях [14, 16]. Микробиологическим методом была установлена концентрация пенициллина в инкубационной среде, приводящая к значительным изменениям жизнеспособности бледной трепонемы, и был определен уровень пенициллина в крови, обеспечивающий элиминацию возбудителя из очага поражения при экспериментальном орхите у кроликов. На основании этих исследований принято считать, что уровень пенициллина в сыворотке крови > 18 мкг/л минимально достаточен, а > 360 мкг/л максимально эффективен для получения значимого терапевтического результата.
В настоящем исследовании методом высокоэффективной жидкостной хроматографии было изучено содержание бензилпенициллина натриевой соли в цереброспинальной жидкости при внутримышечном введении препарата в процессе терапии пациентов с состоянием серорезистентности и поздними формами сифилиса. Данный антибактериальный препарат является стандартом терапии больных сифилисом и, теоретически, должен обеспечивать максимальную доступность для проникновения в интратекальное пространство.
В результате проведенного исследования было установлено, что в период одного-трех часов после очередной внутримышечной инъекции 1 млн. ЕД бензилпенициллина натриевой соли в режиме 4-кратного либо 6-кратного введения наиболее вероятно (67,3–95,3 % случаев) создание концентрации препарата в цереброспинальной жидкости, находящейся в диапазоне между минимальным трепонемацидным и максимально эффективным уровнем. Вероятность случаев с содержанием препарата ниже минимально достаточного оценивается как 2,1–26,5 %. Уровни, превышающие максимально эффективную концентрацию, возможны в 0,8–21,9 % случаев.
Следует отметить, что используемые критические значения трепонемацидного действия пенициллина экстраполированы с животной модели заболевания и являются полностью правомочными лишь по отношению к ранним формам инфекции и связи между уровнем антибиотика в сосудистом русле и возбудителем, находящимся в ткани. Взаимоотношения между антибактериальным потенциалом цереброспинальной жидкости и инфекционными очагами в центральной нервной системе при поздних формах заболевания могут существенно отличаться, и требуются дальнейшие исследования в этом направлении. В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что, создаваемая в процессе терапии интратекальная концентрация антибактериального препарата может быть недостаточной для эффективной санации центральной нервной системы.