Scientific journal
International Journal of Applied and fundamental research
ISSN 1996-3955
ИФ РИНЦ = 0,564

INTERACTION OF TRITERPENE GLYCOSIDE CUCUMARIOSIDE A2-2 WITH MEMBRANE RECEPTORS OF MOUSE MACROPHAGES

Pislyagin E.A. 1 Yurchenko E.A. 1 Gorpenchenko T.Y. 2 Davidova V.N. 1 Aminin D.L. 1
1 G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry
2 Institute of Biology and Soil Sciences
2222 KB
The molecular mechanism of the immunostimulatory action of triterpene glycoside cucumarioside A2-2 isolated from the Far Eastern sea cucumber Cucumaria japonica was studied. Using fluorescent imaging approach the interaction of cucumarioside A2-2 with membrane receptors of mouse peritoneal macrophages, mainly purine receptors of P2X family (as the membrane targets of glycoside action) was investigated. A pharmacological typing of different membrane receptors and ion channel by various blockers and modulators of Ca2+ transport was carried out. Using flow cytometry and FACS-analysis technique a composite structure of the mouse immune cell population and their participation in the immune response to the glycoside application was revealed.
triterpene glycosides of sea cucumbers
immunomodulatory activity
macrophages
the molecular mechanism of action
purine receptors
1. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. – М.: Мир. 1983. ‒ 264 c.
2. Aminin D.L., Koy C., Dmitrenok P.S., Müller-Hilke B., Koczan D., Arbogast B., Silchenko A.A., Kalinin V.I., Avilov S.A., Stonik V.A., Collin P.D., Thiesen H.J., Deinzer M.L., Glocker M.O. // Journal of Proteomics. ‒ 2009. Vol. 72, № 5. – P. 886–906.
3. Beigi R.D., Dubyak G.R. Endotoxin activation of macrophages does not induce ATP release and autocrine stimulation of P2 nucleotide receptors // Journal of Immunology. ‒ 2000. Vol. 165, № 12. – P. 7189–7198.
4. Burnstock G., Williams M. P2 purinergic receptors: Modulation of cell function and therapeutic potential // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. ‒ 2000. Vol. 295, № 3. – P. 862–869.
5. Di Virgilio F., Chiozzi P., Ferrari D., Falzoni S., Sanz J.M., Morelli A., Torboli M., Bolognesi G., Baricordi O.R. Nucleotide receptors: An emerging family of regulatory molecules in blood cells // Blood. – 2001. Vol. 97, № 3. – P. 587–600.
6. Locovei S., Bao L., Dahl G. Pannexin 1 in erythrocytes: Function without a gap // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2006. Vol. 103, № 20. – P. 7655–7659.
7. North R.A. Molecular physiology of P2X receptors // Physiological reviews. – 2002. Vol. 82, № 4. – P. 1013–1067.

Тритерпеновые гликозиды голотурий изучаются на протяжении длительного времени. Установлено, что они обладают широким спектром биологической активности. Для этих соединений отмечены такие свойства, как антимикробная, иммуномодулирующая, иммуноадьювантная и противовоспалительная активности. Кроме того, тритерпеновые гликозиды обладают выраженной мембранолитической активностью, проявляющейся в микромолярном диапазоне концентраций.

Ранее было показано, что тритерпеновый гликозид кукумариозид A2-2, выделенный из дальневосточной голотурии Cucumaria japonica, в наномолярных концентрациях обладает иммуностимулирующим действием, которое выражаются, главным образом, в активации клеточного звена иммунитета: усиливается адгезия, распластывание и подвижность макрофагов, усиливается фагоцитоз и формирование активных форм кислорода, увеличивается скорость пролиферации лимфоцитов, количество антител-образующих клеток селезенки, индуцируется синтез некоторых цитокинов [2, 8].

Однако, несмотря на большое количество работ, связанных с изучением физиологической активности тритерпеновых гликозидов голотурий, механизм их иммуномодулирующего действия на клеточном и субклеточном уровне изучен недостаточно. Имеющиеся в литературе данные об иммуномодулирующей активности тритерпеновых гликозидов голотурий не дают четкого представления о молекулярных механизмах, лежащих в основе проявления ими стимулирующего эффекта. Практически полностью отсутствуют сведения о мембранных и внутриклеточных мишенях действия гликозидов и сигнальных путях.

Целью исследования являлось выяснение молекулярных механизмов иммуномодулирующего действия тритерпенового гликозида кукумариозида А2-2, выделенного из голотурии Cucumaria japonica.

В рамках поставленной цели предполагалось решить следующие задачи:

1. Исследовать влияние кукумариозида А2-2 на транспорт ионов кальция в иммунокомпетентных клетках и фармакологически определить природу рецепторов, ионных каналов и переносчиков, принимающих участие в Са2+ ответе клеток на действие гликозида;

2. Провести иммуноцитохимическое исследование перитонеальных макрофагов, принимающих участие во взаимодействии с кукумариозидом А2-2.

Материалы и методы исследования

Получение клеток. Макрофаги получали из перитонеальной жидкости мышей линии BALB/с (самки весом 20-22 г). В брюшную полость вводили 3 мл ФСБР и интенсивно пальпировали брюшную полость в течение 1–2 мин [1]. Затем с помощью шприца собирали перитонеальную жидкость и переносили ее на покровные стекла в специальные камеры (объемом 200 мкл) для анализа изображения клеток. Камеры инкубировали в термостате при 37 °С в течение 1 часа до полного прикрепления макрофагов ко дну камеры. В дальнейшем клеточный монослой использовали для окрашивания специфическими флуоресцентными зондами и последующего анализа изображения клеток.

Микроцитофлуориметрическая оценка транспорта Са2+. После адгезии и промывки прикрепившиеся макрофаги нагружали зондом Fura-2/AM (10 мкM, Molecular Probes, USA) стекла с клетками монтировали в проточной камере (RC-30HV, Warner Instruments, USA) на предметном столе системы для ратиометрической регистрации флуоресценции клеток (Cairn Research Ltd., UK). Измерение [Са2+]i в клетках осуществлялось инструментальными средствами программы AQM Advance 6 (Kinetic Imaging Ltd., UK).

Иммуноцитохимическое исследование перитонеальных макрофагов. Перитонеальные макрофаги мыши (адгезированные на покровных стеклах или суспензированные в ФСБР) фиксировали путем добавления по каплям холодного 100 %-ного метанола в течение 5 мин при интенсивном встряхивании, трижды промывали ФСБР и блокировали неспецифическое связывание 10 %-ной эмбриональной телячьей сывороткой в ФСБР, содержащей 0,2 % Triton X-100, при комнатной температуре. После промывки в ФСБР клетки инкубировали с первичными антителами в 5 %-ной сыворотке в ФСБР 18 ч при 4 °С, а затем с конъюгированными с флуорохромами вторичными антителами согласно протоколам производителей. Для выявления F4/80 и CD14 маркеров использовали первичные антитела (BioLegend Ltd., США); для выявления пуриновых рецепторов P2X1 (Abcam, Великобритания), P2X4 или P2X7 (Biorbyt Ltd., Великобритания); FITC- или TRITC-конъюгированные вторичные антитела (BioLegend Ltd., США; Abcam, Великобритания). Флуоресцентное изображение монослоя клеток получали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM510 META (Zeiss, Германия). Суспензию перитонеальных макрофагов помещали в проточный цитофлуориметр FACScalibur (Becton-Dickinson, США). Оценку результатов проводили с помощью программного обеспечения LSM510 Release 3.5 (Zeiss, Германия), BD CellQuest Pro (Becton-Dickinson, США) и WinMDI 2.9 (США) соответственно.

Результаты исследования и их обсуждение

Влияние кукумариозида А2-2 на функционирование пуриновых рецепторов в макрофагах

В настоящее время очевидно, что АТФ (и некоторые другие нуклеотиды) могут выполнять роль нейротрансмиттеров и модуляторов клеточных сигналов во многих типах клеток и периферических тканях. Было установлено, что физиологические эффекты внеклеточной АТФ реализуются посредством специфических рецепторов, получивших название пуринорецепторы. Агонистами этих рецепторов являются не только пуриновые, но и пиримидиновые нуклеотиды. Мембрано-ассоциированные пуриновые рецепторы Р2Х семейства по механизму реализации своего эффекта являются лиганд-оперирующими ионными каналами, регулирующими, главным образом, вход Са2+ в клетки, тогда как P2Y рецепторы имеют G-протеин-опосредованный механизм [4, 7].

В нашей работе изучалась возможность участия пуриновых рецепторов Р2Х семейства в активации транспорта Са2+ и стимуляции перитонеальных мышиных макрофагов кукумариозидом А2-2. В ходе наших исследований было показано, что добавление АТФ к монослою перитонеальных макрофагов в микромолярных концентрациях (10–100 мкМ) вызывает резкое обратимое увеличение концентрации цитоплазматического кальция в клетках (Рис. 1, Б). Было установлено, что наблюдается определенная схожесть в действии на макрофаги кукумариозида А2-2 и АТФ: одинаковая амплитуда и временной диапазон длительности пика (Рис. 1), а также одинаковое количество отвечающих на индукторы клеток, составляющее примерно 20 %–25 % от общего числа регистрируемых клеток.

pis1.tif


Рис. 1. Влияние кукумариозида A2-2 и АТФ на динамику изменения Ca2+ ответа перитонеальных макрофагов мыши, нагруженных зондом Fura-2/AM. Изменение продолжительности (A, Б) и амплитуды (В, Г) Ca2+ ответа клеток (∆F) под воздействием индукторов. Стрелки указывают время введения индукторов. Данные представлены как m ± sd

Хорошо известно, что АТФ вызывает вход Са2+ в цитоплазму перитонеальных макрофагов мыши из внешней среды благодаря избирательному взаимодействию с пуриновыми рецепторами семейства P2X, локализованными в мембранах [9]. Предполагается, что перитонеальные макрофаги мыши содержат ограниченный набор пуриновых рецепторов Р2Х семейства: Р2Х1, Р2Х4 и, возможно, Р2Х7 [9]. Чтобы определить, какие именно P2X рецепторы участвуют в Са2+ ответе макрофагов на действие гликозида, мы использовали ряд относительно селективных блокаторов Р2Х рецепторов: сурамин (Р2Х1); PPADS (Р2Х1); феноловый красный (Р2Х1); фенолфталеин (Р2Х4); бриллиантовый голубой G-250 (Р2Х4, Р2Х7) и KN-62 (Р2Х7) (Sigma-RBI eHandbook).

Результаты экспериментов по регистрации Са2+ ответа макрофагов на добавление кукумариозида А2-2 после предварительного инкубирования клеток с блокаторами представлены на рис. 2, А. Из приведенных результатов видно, что наиболее эффективными являются фенолфталеин (наиболее селективен к Р2Х4 рецепторам) и BBG (наиболее селективен к Р2Х4 и Р2Х7 рецепторам), в микромолярных концентрациях ингибирующих стимулирующее действие кукумариозида А2-2 на 100 % и 50 % соответственно. В то же время, использование блокаторов P2X1 рецепторов, таких как сурамин и PPADS, не приводило к статистически значимому блокированию, а при использовании фенолового красного наблюдалось лишь незначительное (порядка 30 %) ингибирование входа Са2+ в клетки. Применение соединения KN-62, высоко селективного блокатора Р2Х7 рецепторов, также не привело к значимым изменениям в динамике транспорта Са2+.

pis2.tif

Рис. 2. А – влияние блокаторов пуриновых рецепторов и фермента апиразы на вход Са2+ в перитонеальные макрофаги мыши линии Balb/с. Данные представлены как m ± sd. Б – изменения внутриклеточной концентрации Са2+ после применения кукумариозида А2-2 в концентрации 2 мкМ в присутствии фермента апиразы. Сокращения: Sur – сурамин; PhR – феноловый красный; Phph – фенолфталеин; BBG – бриллиантовый голубой G-250; apyrase – апираза

pis3.tif

Рис. 3. Определение геометрических размеров клеток в популяции перитонеальных макрофагов мыши линии BALB/c методами А – проточной цитофлуорометрии и Б – микроскопии. В –локализация пуриновых рецепторов Р2Х типа на поверхности перитонеальных макрофагов методом иммуноцитохимии и последующей конфокальной микроскопии. Определение количества F4/80+ клеток (зрелые макрофаги) в популяции перитонеальных макрофагов мыши Г, Д – методом проточной цитофлуориметрии и Е – конфокальной микроскопии, и колокализация Р2Х4+ / F4/80+ клеток установленная методами Ж – проточной цитофлуориметрии и З – конфокальной микроскопии

 

Фермент апираза (аденозиндифосфатаза) способен расщеплять АТФ путем отщепления остатков фосфорной кислоты и тем самым удалять АТФ из инкубационной среды. В процессе выделения и получения первичной культуры клеток во внешней культуральной среде всегда присутствует незначительное количество АТФ вследствие механического разрушения части клеток при манипуляциях с ними, а также за счет выброса АТФ из клеток по нелитическому механизму (например, через каналы типа Pannexin 1) [6]. Установлено, что культура перитонеальных макрофагов постоянно содержит АТФ во внешней среде в диапазоне концентраций 0,1–10,0 нМ [3]. В наших экспериментах предварительная обработка культуры макрофагов апиразой в концентрации 20 ед/мл в течение 3 ч, приводящая к полному устранению АТФ из инкубационной среды, ингибировала активирующее влияние кукумариозида А2-2 на вход Са2+ в макрофаги практически на 100 % (Рис. 2, А).

Семь пуриновых рецепторов Р2Х семейства (P2X1-P2X7) ранее были обнаружены в теплокровных животных, а мРНК для P2X1, P2X4 и P2X7 рецепторов были идентифицированы в клетках иммунной системы, таких как моноциты, макрофаги и микроглия головного мозга [7]. В перитонеальных макрофагах мыши эти рецепторы воспринимают внешние сигналы, опосредованные внеклеточным АТФ, и принимают участие в модуляции клеточной активности с участием входящих в цитоплазму ионов кальция, высвобождением различных цитокинов, в фагоцитозе, в процессах хемотаксиса и формировании воспаления, а также в инициации апоптоза. В настоящий момент роли пуриновых рецепторов в формировании иммунного ответа клеток в ответ на разнообразные стимулы придается большое значение, а поиски новых агонистов и антагонистов пуриновых рецепторов могут привести к созданию новых препаратов, эффективных в лечении различных заболеваний иммунной системы [5, 10].

В данной серии экспериментов нами было показано, что одними из наиболее вероятных молекулярных мишеней действия кукумариозида А2-2 могут быть пуринергические рецепторы Р2Х семейства (преимущественно Р2Х1 и Р2Х4 типа). Взаимодействие кукумариозида А2-2 с этими рецепторами может приводить к активации входа Са2+ в клетки и временному увеличению [Ca2+]i, а применение определенных селективных блокаторов этих рецепторов ингибирует процесс активации кальциевого транспорта. Полное отсутствие влияния гликозида на вход ионов кальция в культуре макрофагов, предварительно инкубированных с апиразой, свидетельствует о необходимости и важности присутствия АТФ для проявления стимулирующего эффекта кукумариозида А2-2. Это указывает на то, что гликозид не является непосредственным агонистом пуриновых рецепторов макрофагов, но может выступать в качестве аллостерического модулятора, проявляющего свой стимулирующий эффект в присутствии незначительных количеств специфического лиганда – АТФ.

Типирование популяции перитонеальных макрофагов мыши, принимающих участие в Са2+ ответе на кукумариозид А2-2

Обнаружено, что популяция перитонеальных макрофагов мыши не однородна и состоит как минимум из двух субпопуляций клеток, различающихся по размеру и гранулированности (маленькие макрофаги с размером 7,13 ± 0,88 мкм и крупные макрофаги 12,77 ± 2,20 мкм в диаметре) (Рис. 3, А-Б). Только субпопуляция крупных зрелых макрофагов окрашивается антителами к F4/80 (Рис. 3, Е). CD14+ моноциты/макрофаги в культуре не выявлены. На поверхности макрофагов всех субпопуляций выявлены пуриновые рецепторы Р2Х1 и Р2Х4 типа, в то время как рецепторы Р2Х7 типа обнаруживаются в незначительных количествах (Рис. 3, В). Установлено, что плотность пуриновых рецепторов варьирует: выявляются макрофаги (порядка 25–35 %) с повышенной плотностью пуриновых рецепторов, локализованных на F4/80+ макрофагах. Не исключено, что именно такие макрофаги принимают участие в Са2+ -ответе на аппликацию кукумариозида А2-2 (Рис. 3, Ж, З).

Заключение

Таким образом, нами было показано, что кукумариозид А2-2 в субтоксических иммуномодулирующих концентрациях способен активировать резкий и обратимый вход ионов кальция в клетки из внеклеточного пространства. Мембранными мишеней действия гликозида являются пуриновые рецепторы Р2Х семейства (Р2Х1 и Р2Х4 типы), обеспечивающие Са2+-проводимость в мембране макрофагов. Иммуномодулирующее действие кукумариозида А2-2, вероятнее всего, связано с тем, что кукумариозид А2-2 действует в качестве аллостерического модулятора пуриновых рецепторов, связываясь с ними, усиливая ответ клеток на АТФ.

В перитонеальной полости мыши присутствует как минимум две субпопуляции макрофагов, различающиеся размерами, наличием маркеров зрелых макрофагов F4/80 и плотностью пуриновых рецепторов Р2Х1 и Р2Х4 типа. Очевидно, именно крупные F4/80+ / P2X+ положительные перитонеальные макрофаги с повышенной плотностью пуриновых рецепторов принимают участие в Са2+ ответе на аппликацию кукумариозида А2-2.

Благодарности. Авторы выражают благодарность сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН д.х.н., в.н.с. Авилову С.А. и к.х.н., н.с. Сильченко А.С. за любезное предоставление кукумариозида А2-2. Работа поддержана грантом РФФИ № 14-04-31435 мол_а. Часть работы, связанной с типированием перитонеальных макрофагов, была выполнена при поддержке гранта РНФ №14-25-00037.