Злокачественные лимфомы (ЗЛ) на сегодняшний день являются как одними из самых курабельных онкологических заболеваний, так и одними из самых быстро распространяющихся. За 20 лет темпы роста заболеваемости ЗЛ увеличились на 50 % [3]. Согласно последним статистическим данным в России ЗЛ в структуре онкологической заболеваемости занимают 1-е место у мужчин и 4-е у женщин 15-40 лет, а среди детского населения лимфомы стоят на 3-м и 4-м месте у мальчиков и девочек, соответственно [4].
Выживаемость больных во многом зависит от диагностируемой стадии лимфомы, например, достоверно известно, что пациенты с I и II стадиями имеют большую продолжительность жизни, чем больные с III и IV стадиями [3]. С цитогенетической точки зрения, возникает вопрос, есть ли связь между таким распределением и частотой хромосомных нарушений лимфоцитов на разных стадиях лимфом. Известно, что ЗЛ вызывают перестройки IG и TCR генов В и Т-лимфоцитов, что приводит к появлению хромосомных аберраций [6]. Данные показывают, что во многих случаях при ЗЛ возникают хромосомные транслокации, влияние которых на развитие опухоли еще не до конца изучено [7,8]. Не смотря на то, что некоторые конкретные траслокации исследователи соотносят с определенным типом лимфом, в целом, считается, что появление хромосомных нестабильностей при ЗЛ носит стохастический характер [5].Однако не известно, зависит ли частота возникновения хромосомных мутаций от стадии заболевания.
Целью данного исследования явилось изучение уровня спонтанного мутагенеза на разных стадиях развития злокачественных лимфом у жителей Курской области.
Материалы и методы исследования
Материалом для данного исследования послужила выборка из 37 больных ЗЛ жителей Курской области, при этом у двоих наблюдалась I стадия заболевания, II стадия – у 13 человек, III – у 15 и IV – у 7 больных.
Приготовление цитогенетических препаратов осуществлялось с помощью полумикрометода [2]. Для получения культуры лимфоцитов из периферической крови проводили стимуляцию клеток ФГА и инкубировали в течение 72 часов. Обработка колхицином проводилась в течение 1, 5 часов, затем материал гипотонизировали и фиксировали. Готовые препараты окрашивали рутинным методом красителем Романовского-Гимза. Статистическую обработку полученных результатов проводили в программе Microsoft Excel 2010.
Результаты исследования
и их обсуждение
Результаты анализа частоты возникновения спонтанных хромосомных мутаций в зависимости от различных стадий ЗЛ представлены в табл. 1.
Таблица 1
Уровень спонтанного мутагенеза у больных с разными стадиями ЗЛ
|
Показатель/ Стадия ЗЛ |
M±Std.Dev. |
|||
|
I стадия |
II стадия |
III стадия |
IV стадия |
|
|
Кол-во аберрантных кл. |
2,00±2,83 |
3,46±1,61 |
4,00±2,56 |
3,57±2,63 |
|
Кол-во аберраций |
2,00±2,83 |
6,00±6,04 |
4,40±2,77 |
4,00±3,00 |
|
Число поврежденных хромосом |
1,5±2,12 |
6,15±6,32 |
5,06±3,47 |
4,57±3,95 |
|
Кол-во аберраций хроматидного типа |
1,5±2,12 |
2,07±1,32 |
2,13±1,50 |
1,71±1,71 |
|
Кол-во аберраций хромосомного типа |
0,00 |
4,00±5,72 |
2,27±1,87 |
2,29±2,29 |
|
Количество одиночных фрагментов |
0,50±0,70 |
1,92±1,26 |
2,13±1,5 |
1,57±1,81 |
|
Количество парных фрагментов |
0,00 |
2,46±3,30 |
1,27±1,16 |
1,14±1,06 |
|
Количество хроматидных обменов |
1,50±2,12 |
0,07±0,27 |
0,00 |
0,14±0,37 |
|
Количество хромосомных обменов |
0,00 |
1,53±3,18 |
1,00±1,70 |
1,14±1,86 |
Из таблицы видно, что при первой стадии ЗЛ количество аберрантных клеток составляет 2,00±2,83, частота хромосомных аберраций при этом так же равна 2,00±2,83 %. Число поврежденных хромосом равно 1,5±2,12, причем присутствуют аберрации только хроматидного типа. В структуре нарушений преобладают хроматидные обмены – 75 %, а ацентрические одиночные фрагменты составляют только 25 %.
Вторая стадия ЗЛ характеризуется большим количеством аберрантных клеток, количество которых равно 3,46±1,61. Уровень спонтанного мутагенеза оказался значительно выше, чем при I стадии – 6,00±6,04 %, а число поврежденных хромосом составило 6,15±6,32. В данном случае обнаруживаются аберрации хромосомного типа, причем они преобладают – 65 %, а на аберрации хроматидного типа приходится уже только 35 %.. Количество ацентрический парных и одиночных фрагментов оказалось равно, соответственно, 41 и 30 %. Далее по количеству идут хромосомные обмены 26 % и хроматидные обмены 3 %.
У больных с III стадией ЗЛ количество аберрантных клеток оказалось равно 4,00±2,56, а количество аберраций составило 4,40±2,77 %, причем число поврежденных хромосом было равно 5,06±3,47. Соотношение количества аберраций хроматидного и хромосомного типов примерно одинаковое – 49 и 51 %. Из первых, в данном случае, встречаются только одиночные фрагменты, а хроматидных обменов не наблюдается. Количество парных фрагментов и хромосомных обменов составило 28 и 23 %, соответственно.
На последней стадии ЗЛ количество аберрантных клеток составляет 3,57±2,63. Уровень спонтанного мутагенеза равен 4,00±3,00 %, а среднее число поврежденных хромосом – 4,57±3,95. На IV стадии соотношение типов аберраций таково: хроматидный тип нарушений – 42 %, хромосомный тип нарушений – 58 %. В структуре хромосомных аберраций преобладают ацентрические одиночные фрагменты 39 %, затем идут парные фрагменты и хромосомные обмены по 28 % и на хроматидные обмены приходится 5 %.
Проведенная далее обработка полученных данных с помощью критерия Фишера позволила выявить статистически значимые различия в распределении кариотипических нарушений у больных ЗЛ на разных стадиях.
Сравнение показало, что I стадия существенно отличается по количеству хроматидных обменов от II (F= 58,5) и IV (F=31,5) стадий, на III стадии данный показатель совсем отсутствует.
Важно отметить, что вторая стадия ЗЛ статистически отличается от других практически по всем показателям. В целях наглядности структура отличий II стадии с указанием значений F-критерия представлена в табл. 2.
Таблица 2
Значения F-критерия для показателей, различающихся при II стадии ЗЛ и других стадиях
|
Показатель/Стадия |
I стадия |
III стадия |
IV стадия |
|
Кол-во аберраций |
4,75 (0,01) |
||
|
Кол-во поврежденных хромосом |
3,31 (0,03) |
||
|
Кол-во аберраций хромосомного типа |
9,34 (0,01) |
6,23 (0,03) |
|
|
Кол-во парных фрагментов |
8,09 (0,01) |
9,57 (0,01) |
|
|
Кол-во хроматидных обменов |
58,5 (0,01) |
||
|
Кол-во хромосомных обменов |
3,37 (0,03) |
Из таблицы видно, что наибольшее расхождение показателей наблюдается при сравнении II стадии с III стадией. Основным отличным показателем II стадии от остальных является количество аберраций хромосомного типа (F=9,34; F=6,23), которое складывается из большего числа ацентрических парных фрагментов (F=8,09; F=9,57) и хромосомных обменов (F=3,37).При сравнении III и IV стадий статистически значимых различий не было выявлено.
Заключение
Таким образом, в результате исследования были установлены значения уровня спонтанного мутагенеза для разных стадий ЗЛ, которые составили для I стадии – 2,00±2,83 %, для II стадии – 6,00±6,04 %, для III стадии – 4,40±2,77 %, для IV стадии – 4,00±3,00 %. За контрольное значение, мы приняли уровень спонтанного мутагенеза у жителей Европейской части России и стран СНГ равный 2,13±0,09 % [1].
Так же была выявлена специфическая для каждой стадии структура кариотипических нарушений, отражающая количественное соотношение хромосомных и хроматидных типов аберраций: при I стадии оно равно 0:100 %, соответственно, при II стадии – 65:35 %, при III – 51:49 %, при IV – 58:42 %.
Сравнение уровня спонтанного мутагенеза показало, что на первой стадии ЗЛ он не превышает нормальных значений для жителей данной территории, и что нарушения возникают в уже сформированных хромосомах при делении лимфоцитов.
Вторая стадия ЗЛ отличается наиболее выраженными аберрационными процессами, причем преобладание хромосомных типов нарушений над хроматидными свидетельствует о том, что большинство повреждений возникают еще до начала удвоения хромосом в период интерфазы.
Третья и четвертая стадия демонстрируют однородные высокие значения уровня спонтанного мутагенеза и сходную картину структуры аберраций. Подобные результаты можно объяснить тем, что данные стадии имеют сходный характер повреждения лимфатических органов.