Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

В настоящее время развитие передовых технологий лечения онкологических заболеваний, подтвержденных экспериментальными исследованиями последних лет, свидетельствуют об актуальности использования физических факторов, таких как электромагнитное излучение оптического диапазона, в качестве средств и методов, усиливающих эффективность базовой противоопухолевой терапии, обладающих в определенных режимах ингибирующим воздействием на опухоль, процессы метастазирования и рецидивирования и способных купировать ее возможные осложнения.

Проблемы регуляции важнейших клеточных функций, таких как пролиферация, дифференцировка, апоптоз, имеют значение не только для понимания фундаментальных основ жизнедеятельности организма на разных уровнях его организации при нормально протекающих физиологических процессах, но и для поиска оптимальных способов воздействия на указанные клеточные функции, при возникновении патологических состояний, в частности, злокачественных опухолей. [8, 11, 12]. В настоящий момент активно разрабатываются методы с использованием различных физических факторов с механизмами действия, направленными на активацию различных систем противоопухолевой защиты, способных блокировать процессы пролиферации и индуцировать апоптоз опухолевых клеток, стимулировать цитотоксичность естественных киллеров [2, 3, 4, 5, 6, 9]. Актуальность использования оптических излучений связана с тем, что для получения выраженной ответной реакции достаточно небольших доз таких излучений [7, 8]. С этих позиций представляется интересным исследовать прямое действие электромагнитных колебаний оптического диапазона на опухолевые клетки. Целью настоящего исследования было изучение прямого эффекта зеленого и оранжевого спектра с фиксированной одинаковой энергетической дозой на жизнеспособность опухолевых клеток культуры С45.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования служили опухолевые клетки саркомы С45. Для получения культуры клеток брали кусочек опухоли саркомы 45 размером 0,5х0,5 см гомогенизировали, после чего клеточную суспензию фильтровали через тонкое стальное сито, наслаивали на фикол-верографин ρ=1.078 и центрифугировали при 1500 об/мин. 15 минут. Полученное «кольцо» из опухолевых клеток трижды отмывали средой 199, взвесь клеток разводили этой же средой до 2-1,5·106 и распределяли по пенициллиновым флаконам или флаконах Карреля по 200000 в 2 мл питательной среды 199, смешанной со средой Игла (1:1) с добавлением 10 % сыворотки плода коровы в присутствии гентамицина (100 ед/мл), согласно требованиям, предъявленным к работе с клеточными культурами [10]. Через два часа осуществляли изучаемые воздействия, показатели снимали на следующий день.

Всего исследовали четыре группы для каждого спектра. Опытные группы подвергались электромагнитным излучениям оптического диапазона, полученным от лазерно-светодиодного аппарата «Спектр-ЛЦ». Исследовали: оранжевый λ=0,65 мкм и зеленый λ=0,56мкм спектр. Излучение подавалось с одинаковой для всех режимов энергетической дозой: – W=3 Дж/см2. В первой группе проб излучение подавалось с частотой 5 Гц, во второй – 50 ГЦ, в третье – 5Г-50 Гц.Четвертая группа- контрольная, опухоль без воздействия. Затем пробы помещали в термостат на 24 часа при 37°С. Контрольные пробы инкубировали в аналогичных условиях без облучения. Было проведено четыре серии таких экспериментов.

Количество клеток культуры C45 определяли с использованием камеры Горяева, процент погибших клеток контрольной и опытных проб оценивали по общепринятому тесту с трипановым синим (Sigma, США). Цитотоксический индекс (ЦТИ) вычисляли по формуле ЦТИ = (О – К / К) х 100 %, где О – количество погибших клеток в опытной пробе; К – в контрольной пробе. Цитопатический индекс вычисляли как отношение числа погибших к общему числу опухолевых клеток (ЦПИ): при 1 к 10 оценивали как низкий ЦПИ, 1 к 2(5) – как средний ЦПИ, и 1 к 1 (2:3)-как высокий ЦПИ. Одновременно готовили мазки, фиксировали, окрашивали по Романовскому-Гимзе, микроскопировали и проводили оценку цитологического состояния C45, рассчитывали индекс апоптоза [3, 5]. Достоверность различий средних величин определяли с применением t критерия Стьюдента и непараметрическими методами.

Результаты исследования и их обсуждение

На контрольных цитологических препаратах культура С45 была представлена однотипными клетками веретенообразной формы, плотно прилегающими друг к другу, с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением (выше 1). Цитоплазма отчетливо базофильна. Ядро округлое, гомогенное, базофильное с наличием 2-3 ядрышек. Типичным являлось наличие в поле зрения значительного количества клеток с митотическими фигурами деления. Регистрировался низкий индекс апоптоза (4,8±0,1 %). В единичных клетках отмечались патологические фигуры деления. После воздействия на клетки культуры С45 оптическим излучением различного спектрального диапазона были получены однонаправленные изменения клеток культуры различной степени выраженности, но сходные между собой. Была отмечена остановка клеточного деления, отсутствие фигур деления в большинстве проб. Культура была представлена полиморфными клетками атипичной формы. Усиление клеточного полиморфизма происходило за счет сморщивания и пикноза одних клеток и набухания с увеличением размеров других. Отмечалась оксифилия цитоплазмы; отсутствие ядрышек в ядрах. Наблюдались поля «голых» одиночно лежащих клеток. Ядерно-цитоплазматическое отношение было меньше 1. Такие изменения в литературе трактуются как морфологические признаки апоптоза [3, 8, 11, 12].

Следует отметить, что при действии оранжевого спектра наравне с перечисленными выше морфологическими характеристиками клеток были обнаружены большие массивы некротизированных, с поврежденными мембранами, лизированных клеток C45, утративших четкость формы. Было отмечено большое количество погибших клеток в виде мелкого детрита или теней. Значения индексов апоптоза (ИА %) были относительно низкие (табл. 1). Действие оранжевой части спектра приводит к повышению количества погибших клеток культуры через 24 по сравнению с действием зеленого спектра; при 5Гц в 1.7 раз, при 50Гц в 1.4 раза, при 5-50Гц в 1.3 раза. (табл. 1). Индексы ЦТИ при воздействии оранжевым спектром были высокие. Следует отметить, что при применении оранжевого света значения ИА % были достоверно ниже (при 5Гц) или достоверно не отличались от контрольных (при 50Гц), из чего можно заключить, что отмеченная гибель клеток, по-видимому, не является апоптотической. Судя по цитологическим изменениям, она происходила преимущественно за счет некроза, хотя в небольшой части клеток были обнаружены и изменения, характерные для апоптоза. Отмеченные изменения могут свидетельствовать о прямом цитотоксическом, разрушительном действии оранжевого спектра в используемой дозе на клетки культуры С45 [10].

В пробах после воздействия зеленого света отмечались массивы изолированно лежащих друг от друга, сморщенных клеток с конденсированным хроматином, который располагался по периферии ядер. Определялись поля ядер, в которых четко дифференцировались глыбки хроматина с четкими правильными краями. Значения ИА % были высокие по сравнению с воздействиями оранжевого спектра (см таблицу): в 8 раз выше, чем при 5 Гц; в 7,8 раз выше, чем при 50Гц и в 2,8 раз выше в группе 5-50Гц. (Р<0,01). Облучение той же дозой зеленого спектра вызывало повышение % погибших клеток, по сравнению с контролем, но при снижении индекса ЦТИ. Полученные данные позволяют предположить, что вклад апоптоза в общую гибель клеток оказался более существенным при действии зеленого спектра по сравнению с оранжевым

Как видно из таблицы, различные длины волн неодинаково влияют на гибель клеток С45. Во всех изученных опытных пробах число погибших клеток по сравнению с контролем было статистически достоверно выше (Р<0,01). При сравнении уровня погибших клеток в зависимости от частоты подачи сигнала, при обоих спектрах и постоянной энергетической дозе, следует отметить увеличение % гибели опухолевых клеток при нарастании частоты фактора: при сравнении 5Гц и 50Гцв среднем 1,3 раза, при 5Гц и 5-50Гц в 1,5 раз, а 50Гц и 5-50Гц в 1,2 раза. (Р<0,01).

Влияние электромагнитных колебаний оптического диапазона с различной длиной волны на гибель клеток культуры С45

Примечание.* отличия достоверны по отношению к контролю при р≤0,05.

При анализе цитопатических индексов, получены следующие результаты: в контроле без воздействия –самый низкий, в остальных группах: при оранжевом спектре во всех пробах- высокий, при зеленом свете ЦПИ – средний при 5 Гц и при 50 Гц, и только в пробах 5-50 Гц – высокий (табл. 1). Степень выраженности изменений С45 зависит также от частоты подачи сигнала. Наибольшая активность гибели опухолевых клеток была зафиксирована при частоте 5-50 Гц.

Таким образом, после проведения воздействия оптическим излучением в одних и тех же энергетических дозах, но различными полосами спектра на клетки культуры С45 были получены различные результаты. Оранжевый спектр вызывал непосредственную гибель клеток путем некроза, в других случаях, как видно из полученных данных, были запущены механизмы апоптоза. Апоптоз или программированная клеточная гибель является генетически детерминированным процессом, который может протекать в нормальных клетках и тканях организма на определенных стадиях его развития, либо может быть индуцирован в тех же самых клетках и тканях организма in vivo и полученных из них клеток и клеточных линий in vitro [11]. Апоптотическая гибель может быть вызвана самыми разнообразными физическими, химическими и биологическими факторами, но финальные фазы процесса протекают сходным образом независимо от индуктора гибели и типа клеток [9, 12]. Нами установлено, что механизмы апоптоза были запущены с помощью некоторых электромагнитных воздействий оптического диапазона. Апоптотические клетки культуры опухоли С45 претерпевают определенные морфологические изменения, отражающие происходящие в них биохимические процессы. Морфологически апоптоз проявлялся гибелью единичных, беспорядочно расположенных клеток, что сопровождалось формированием округлых, окруженных мембраной телец, получивших название апоптические тельца [3, 8, 12]. Апоптоз – форма гибели клетки, проявляющаяся в уменьшении ее размера, конденсации и фрагментации хроматина, уплотнении наружной и цитоплазматических мембран без выхода содержимого клетки в окружающую среду [3]. Подобные изменения, в разной степени выраженности, были нами зафиксированы на культурах К562, L 929, лимфосаркомы Плисса и др. при действии различных оптических излучений [4, 5, 6, 7, 8, 9]. Наблюдаемые нами в этом исследовании морфологические изменения опухолевых клеток культуры С45, носят сходный характер: клетки сморщенные, выглядят как овальные или округлые скопления эозинофильной конденсированной цитоплазмы с плотными фрагментами ядерного хроматина, причем такие морфологические признаки в культуре С45 были более выражены при действии зеленого света. При действии оранжевого света гибель клеток опухоли осуществляется преимущественно путем некроза.

Заключение

Полученные данные представляют собой научный интерес и могут быть использованы с целью выбора оптимальных параметров оптического излучения для достижения эффекта моделирования путей гибели опухолевых клеток.