Scientific journal

International Journal of Applied and fundamental research

ISSN 1996-3955

ИФ РИНЦ = 0,593

Известно, что микроРНК вовлечены в патогенез злокачественных заболеваний, в том числе и при раке молочной железы (РМЖ), а также при развитии стресс индуцированного ответа организма на внеклеточные сигналы, например на N-этил-N-нитрозомочевину [2-8]. Более того, уровни экспрессии микроРНК клетками солидных опухолей различаются в одной и той же опухоли [5]. Имеются сведения о взаимосвязи уровней экспрессии тканью опухоли микроРНК с уровнями микроРНК в крови [7]. Однако нет исследований сопряженности уровней микроРНК тканями опухоли молочных желез при РМЖ с уровнями микроРНК в лимфе грудного протока. Поэтому целью исследования стало изучение уровней экспрессии микроРНК в тканях опухоли при РМЖ, индуцированным N-метил-N-нитрозомочевиной, а также их взаимосвязи с уровнями микроРНК в крови и лимфе с учетом способа лечения у крыс Wistar.

Материал и методы исследования

Эксперименты на лабораторных животных проведены в соответствии с соблюдением принципов Хельсинской декларации BMA (2000). Эксперименты выполнены на 25 неполовозрелых крысах-самках линии Wistar. Животные содержались на стандартной лабораторной диете и имели свободный доступ к воде. У 21 крысы РМЖ индуцировали N-метил-N-нитрозомочевиной (30 мг/кг, Sigma-Aldrich, США), а 4 особи составили группу контроля. Через 6 месяцев у 17 крыс оперативно удалили опухоль молочной железы, а 4 особям не проводилось хирургическое вмешательство до завершения курса неоадъювантной полихимиотерапии (ПХТ) и только после этого была проведена резекция опухоли молочной железы. После оперативного вмешательства часть животных получила курс ПХТ (n=5), а также у части животных к стандартной ПХТ была добавлена терапия фрагментированной экзогенной ДНК (n=5). Курс ПХТ включал 5-фторурацил (Ebewe, Австрия в дозе 15 мг/кг внутрибрюшинно на 1 и 8 день курса терапии), метотрексат (Ebewe, Австрия в дозе 2,5 мг/кг внутрибрюшинно на 1 и 8 день курса терапии) и циклофосфан (ОАО «Биохимия», Саранск в дозе 3 мг/кг внутрибрюшинно ежедневно однократно 14 дней). Курс терапии фрагментированной ДНК (5мг/кг) проводили внутрибрюшинным введением однократно в течение 14 дней через 3 часа после введения циклофосфана. В экспериментах использовали субстанцию препарата Панаген с содержанием фрагментированной ДНК 1,7 мг/мл. Для устранения негативного эффекта цитостатических препаратов, используемых для ПХТ, назначают курс терапии экзогенной ДНК. Кроме этого, показано противоопухолевое действие экзогенной ДНК [1]. Животных из эксперимента выводили через 6,5 месяцев под наркозом (40 мг/кг нембутана внутрибрюшинно; Sigma-Aldrich, США), что обусловливалась необходимостью прижизненного сбора лимфы из грудного лимфатического протока. Тотальную РНК выделяли из тканей молочной железы, сыворотки крови и лимфы грудного протока с использованием набора реагентов (ЗАО Вектор-БЕСТ) согласно инструкции. Для получения кДНК проводили обратную транскрипцию по матрице микроРНК с использованием набора реагентов (ЗАО Вектор-БЕСТ) согласно инструкции. Для определения количества микроРНК-21, -221, -222 и 429 в тканях молочной железы, сыворотке крови и лимфе грудного протока проводили ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием набора реагентов (ЗАО Вектор-БЕСТ) на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories). В качестве гена сравнения использовали малую РНК U6. Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 6.0, меры центральной тенденции и рассеяния описаны медианой (Ме), нижним (Lq) и верхним (Hq) квартилями; достоверность различия рассчитывалась по U-критерию Манна-Уитни, и принималась при значениях p < 0,05.

Результаты исследования
и их обсуждение

В ходе анализа данных уровней экспрессии тканями опухоли молочных желез микроРНК выявлены статистически значимые различия по некоторым из них в сравнении с уровнями экспрессии микроРНК в тканях молочных желез интактных животных (табл. 1). В силу колебаний значений экспрессии микроРНК-21 тканями молочных желез в различных экспериментальных группах не выявлено статистически значимых различий, хотя имеется тенденция их роста при РМЖ. По уровням экспрессии тканями молочных желез микроРНК-221 в группе особей с РМЖ установлено статистически значимое возрастание по сравнению с другими группами животных (p < 0,01).

Таблица 1

Уровни экспрессии микроРНК в тканях молочных желез (Me, Lq-Hq)

Примечание: * – достоверность различия с интактными животными p < 0,05; # – достоверность различия с ПХТ p < 0,05; РМЖ – рак молочной железы; ПХТ – неоадъювантная полихимиотерапия.

Уровни экспрессии тканями молочных желез микроРНК-222 были статистически значимо выше в группе особей, получивших хирургическое вмешательство по сравнению с уровнями экспрессии данной микроРНК в группе интактных животных и в группе, особей получивших курс ПХТ (p < 0,01). В отношении уровней экспрессии микроРНК-429 выявлено статистически значимое снижение уровней экспрессии тканями молочных желез микроРНК-429 в группе особей, получивших хирургическое вмешательство по сравнению с уровнями экспрессии данного показателя в группе интактных животных (p < 0,01). В тоже время, в группе особей, получившей курс ПХТ, отмечено статистически значимое возрастание уровней экспрессии микроРНК-429 тканями молочных желез в равнении с интактными животными (p < 0,01). Между уровнями экспрессии микроРНК тканями молочных желез в экспериментальных группах показана сопряженность уровней экспрессии микроРНК-21 с микроРНК-221 в группе интактных животных (r=-0,90; p<0,05). В группе особей, получивших курс ПХТ, выявлена прямая и сильная взаимосвязь уровней экспрессии тканями молочных желез микроРНК-221 с уровнями экспрессии микроРНК-222 (r=0,86; p < 0,01).

Известно, что между уровнями экспрессии микроРНК тканями опухолей и уровнями циркулирующей микроРНК имеется взаимосвязь, поэтому следующим этапом нашей работы стало изучение уровней циркулирующей микроРНК в крови и лимфе грудного протока [7].

Результаты исследований уровней микроРНК в крови представлены в таблице 2. В контрольной группе животных по РМЖ нами отмечено статистически значимое снижение уровней микроРНК-21 в сравнении с контрольной группой животных (p < 0,05). Более того, на фоне ПХТ и сочетания оперативного вмешательства с последующим курсом ПХТ также выявлено статистически значимое снижение уровней микроРНК-21 (p < 0,05). В тоже время, на фоне только оперативного лечения или сочетания оперативного удаления опухоли с последующим курсом ПХТ дополненным терапией экзогенной ДНК, отмечено статистически значимое увеличение уровней микроРНК-21 (p<0,05). В отношении сывороточных уровней микроРНК-221 отмечено статистически значимое увеличение уровней в группах животных, получивших только оперативное вмешательство, так и в сочетании с ПХТ дополненной экзогенной ДНК по сравнению с интактными животными и группой сравнения по РМЖ (p<0,05). Что же касается уровней в сыворотке крови микроРНК-222, то установлено статистически значимое увеличение их в группе животных подвергшихся оперативному вмешательству по поводу РМЖ (p < 0,05). Также, выявлено статистически значимое снижение в сыворотке крови уровней микроРНК-429 в группе животных с РМЖ по сравнению с интактными животными(p < 0,05).

Таблица 2

Уровни микроРНК в сыворотке крови крыс линии Wistar при РМЖ (Me, Lq-Hq)

Примечание: РМЖ – рак молочной железы, индуцированный нитрозомочевиной; ПХТ – полихимиотерапия; операция – проведено оперативное удаление опухоли молочной железы; фрДНК – терапия фрагментированной ДНК из плаценты человека; * – достоверность различия с интактными животными; # – достоверность различия с РМЖ; $ – достоверность различия с группой, получавшей только оперативное лечение; ^ – достоверность различия с группой, получавшей только ПХТ; p < 0,05.

Что касается уровней микроРНК в лимфе грудного протока при РМЖ у крыс Wistar, то они представлены в таблице 3. Так, отмечено статистически значимое увеличение уровней микроРНК-21 в лимфе грудного протока при РМЖ в сравнение с интактными особями (p < 0,05). Кроме этого, выявлено статистически значимое снижение уровней микроРНК-21 в лимфе грудного протока крыс линии Wistar, получавших ПХТ без оперативного вмешательства и в группе крыс, получавших сочетание ПХТ с дополнительным лечением фрагментированной ДНК после хирургического удаления опухоли молочной железы по сравнению с контрольной группой крыс с раком молочной железы (p < 0,05). Установлено статистически значимое снижение уровней микроРНК-222 в лимфе грудного протока у особей подвергшимся ПХТ в любых вариациях в сравнении с интактными животными (p < 0,05). Также, отмечено статистически значимое снижение уровней микроРНК-222 в лимфе грудного протока особей, получавших ПХТ в любых вариациях и в группе, получившей хирургическое лечение по сравнению с контрольной группой по РМЖ (p < 0,05). В лимфе грудного протока крыс, получавших ПХТ после удаления опухоли молочной железы, выявлено статистически значимое снижение уровней микроРНК-222 в сравнении с крысами, получавшими хирургическое лечение (p < 0,05). Что же касается уровней микроРНК-429 в лимфе грудного протока, то было установлено статистически значимое увеличение уровней в группе крыс, получивших сочетание хирургического и терапевтического вида лечения дополненного введением экзогенной ДНК в сравнении с интактными особями (p < 0,05). Кроме этого, данная группа крыс имела статистически значимо большие уровни микроРНК-429 в лимфе грудного протока по сравнению с контрольной группой по РМЖ и группой крыс, получивших только ПХТ (p < 0,05). Также в группе крыс, получивших только ПХТ уровни микроРНК-429 в лимфе грудного протока, были статистически значимо выше по сравнению с контрольной группой крыс по РМЖ (p < 0,05).

Таблица 3

Уровни микроРНК в лимфе крыс линии Wistar при раке молочной железы (Me, Lq-Hq)

Примечание: * – достоверность различия с интактными животными p < 0,05; # – достоверность различия с РМЖ p < 0,05; $ – достоверность различия с группой, получавшей только оперативное лечение p < 0,05;
^ – достоверность различия с группой, получавшей только ПХТ p < 0,05; РМЖ – рак молочной железы, индуцированный нитрозомочевиной; ПХТ – полихимиотерапия; операция – проведено оперативное удаление опухоли молочной железы; фрДНК – лечение фрагментированной ДНК из плаценты человека.

Корреляционный анализ уровней экспрессии микроРНК тканями молочных желез и уровней, циркулирующих микроРНК в крови и лимфе, выявил наличие сопряженности между ними той или иной направленности и силы. Так, в группе интактных особей показана обратная и сильная зависимость уровней микроРНК-222 в крови с аналогичным параметром в тканях молочных желез (r= -0,90; p=0,04). Больше всего взаимосвязей между тканевыми и циркулирующими уровнями микроРНК имеются в группе животных, получивших хирургическое лечение по поводу РМЖ. В частности, тканевые уровни микроРНК-222 имели прямую и сильную сопряженность с аналогичным показателем в лимфе грудного протока (r= 0,89; p=0,02), а с уровнями в крови они носили обратную и высокую зависимость (r= -0,90; p=0,04). В отношении микроРНК-429 показано наличие прямой и сильной взаимосвязи тканевых уровней с уровнем их в сыворотке крови (r=0,54; p=0,04). Более того, уровень тканевой экспрессии микроРНК оказывал существенный эффект на проводимую медикаментозную терапию у животных после резекции опухоли молочных желез. Между тканевой экспрессией микроРНК-221 тканями молочных желез при РМЖ и уровнем в крови микроРНК-221 показана обратная и сильная зависимость (r= -0,52; p=0,05), что, скорее всего, свидетельствует о низкой эффективности ПХТ. Необходимо отметить тот факт, что уровни в тканях молочных желез микроРНК-429 находились в обратной и сильной сопряженности с уровнями микроРНК-429 в лимфе грудного протока особей, получавших сочетание курса ПХТ с фрагментированной ДНК (r= -0,72; p=0,01). Это может быть результатом защитного действия экзогенной ДНК в случаях наличия метастазов в регионарных лимфатических узлах. Об эффективности проводимой ПХТ можно также судить и на основании выявленных взаимосвязей в группе особей, которые получали ее до проведения хирургического лечения. Так, в частности на основании тканевой экспрессии микроРНК-222 и ее уровнем в крови, которая носила обратную и сильную сопряженность можно судить о резистентности клеток опухоли молочной железы к данному курсу ПХТ (r= – 0,82; p=0,01). Более того, наличие обратной и сильной взаимосвязи тканевой экспрессии микроРНК-429 и ее концентрации в лимфе грудного протока в данной группе животных, также свидетельствует о низкой терапевтической эффективности ПХТ (r= -0,83; p=0,04). В тоже время, уровни тканевой экспрессии микроРНК-429 в группе особей, получившей ПХТ до резекции опухолевой ткани, была в прямой и сильной связи с уровнями микроРНК-429 в крови (r=0,89; p=0,02), что, скорее всего, отражает различия в скорости накопления микроРНК в грудном протоке.

Полученные нами результаты исследования уровней микроРНК в тканях опухоли молочных желез, крови и лимфе, не противоречат литературным данным. Показано, что между уровнями микроРНК в тканях опухолей и в крови имеется связь, а также о падение уровней микроРНК на фоне нескольких курсов ПХТ при РМЖ у женщин [2-3, 7-8].

Заключение

Таким образом, при РМЖ у крыс Wistar установлена связь тканевых уровней микроРНК с их количеством в крови и лимфе, а также с клинической эффективностью ПХТ.